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口蹄疫病毒3D蛋白与宿主互作蛋白的筛选及鉴定
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作者 刘永杰 兰喜 +4 位作者 李玉星 张勇 何继军 尚佑军 郑海学 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期13-19,共7页
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄类动物急性、热性,高度接触性传染病。FMDV 3D蛋白是病毒编码RNA的RNA依赖性聚合酶(3D^(pol)),是病毒RNA复制的重要蛋白,有关3D蛋白与宿主蛋白相互作用的报道较少。本研究应用PK-15细... 口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的猪、牛、羊等偶蹄类动物急性、热性,高度接触性传染病。FMDV 3D蛋白是病毒编码RNA的RNA依赖性聚合酶(3D^(pol)),是病毒RNA复制的重要蛋白,有关3D蛋白与宿主蛋白相互作用的报道较少。本研究应用PK-15细胞cDNA酵母表达文库,利用酵母双杂交技术,最终获得与3D有潜在相互作用的15个宿主潜在蛋白,通过免疫共沉淀和共聚焦试验进一步验证,鉴定出宿主ataxin-3和voltage-dependent anion channel 1(VDAC1)与3D具有相互作用,研究结果为宿主蛋白与3D蛋白相互作用在病毒复制中的功能提供了数据支撑。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 3D蛋白 酵母双杂交技术 蛋白质相互作用
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猫杯状病毒感染性克隆的构建及拯救病毒的鉴定
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作者 朱雪敏 李鑫基 +7 位作者 华炯钢 陈柳 叶伟成 张传亮 朱寅初 付媛 张存 云涛 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期20-26,共7页
旨在建立猫杯状病毒(FCV)反向遗传系统,以探究FCV的致病机制,为后续疫苗研发提供科学依据。以FCV HZ2024株为对象,构建DNA-launched感染性克隆系统。FCV全基因组的4个片段被依次插入pAY-CHS重组质粒后转染F81细胞并传代鉴定。结果显示,F... 旨在建立猫杯状病毒(FCV)反向遗传系统,以探究FCV的致病机制,为后续疫苗研发提供科学依据。以FCV HZ2024株为对象,构建DNA-launched感染性克隆系统。FCV全基因组的4个片段被依次插入pAY-CHS重组质粒后转染F81细胞并传代鉴定。结果显示,FCV HZ2024基因片段扩增后插入DNA-launched系统质粒,成功构建DNA-launched系统拯救病毒rFCV HZ2024-RE,转染细胞24 h后出现细胞病变效应,病毒滴度稳定在10^(7)~10^(8T)CID_(50)/m L。间接免疫荧光检测证实VP1蛋白抗原表位完全保留,重组病毒的衣壳蛋白成功表达。且重组病毒与亲本毒株的复制动力学高度相似,蚀斑形态无显著差异。Eco R V酶切及测序验证表明,突变位点(C7183T、A7186C)被精准引入且稳定遗传。总之,构建的DNA-launched系统实现了FCV高效拯救与精准遗传。 展开更多
关键词 猫杯状病毒 感染性克隆 反向遗传学 病毒拯救
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鸭星状病毒1型信阳株全基因组扩增及遗传进化分析
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作者 张敏 李迎晓 +5 位作者 张璐璐 何书海 曲哲会 秦东升 刘纪成 焦凤超 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第2期959-972,共14页
【目的】了解信阳地区鸭星状病毒1型(Duck astrovirus type 1,DAstV1)流行株基因组的演化特征,为进一步研究信阳地区DAstV1的流行、遗传进化及致病特性提供参考依据。【方法】对某养殖场送检的病鸭进行禽腺病毒、禽星状病毒和鸭甲型肝... 【目的】了解信阳地区鸭星状病毒1型(Duck astrovirus type 1,DAstV1)流行株基因组的演化特征,为进一步研究信阳地区DAstV1的流行、遗传进化及致病特性提供参考依据。【方法】对某养殖场送检的病鸭进行禽腺病毒、禽星状病毒和鸭甲型肝炎病毒等12种常见病毒的PCR/RT-PCR筛查。采集病鸭肝脏组织,无菌处理后经卵黄囊途径接种10日龄SPF鸭胚,连续传代4次,并逐代收集尿囊液进行DAstV RT-PCR鉴定。对分离到的病毒进行全基因组测序,并对ORF1a、ORF1b和ORF2基因序列及其编码蛋白的氨基酸变异位点进行比对分析。【结果】送检病料筛查结果显示,禽星状病毒呈阳性。第1~4代鸭胚尿囊液中均呈DAstV1阳性,将该病毒命名为HN24XY06。第4代接种鸭胚全部死亡,死亡胚体发育不良且体表出血。HN24XY06基因组全长7 755 nt,包含ORF1a、ORF1b和ORF2 3个开放阅读框。序列比对和系统发育分析表明,HN24XY06属于DAstV1毒株,与山东分离株DAstV-SDZZ和DAstV-SDWF亲缘关系较近。ORF1a、ORF1b和ORF2蛋白的氨基酸序列分析显示,存在不同程度的突变,多发生在ORF1a编码的氨基酸序列中。【结论】本研究分离到了1株DAstV1,丰富了信阳地区DAstV1的分子流行病学资料,并为进一步研究DAstV1的致病机制奠定了基础。 展开更多
关键词 鸭星状病毒1型(DAstV1) 病毒分离与鉴定 全基因组扩增 遗传进化分析
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一株猪流行性腹泻病毒G2b亚型细胞适应性毒株的复制特性及致病性
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作者 杨帆 胡国芳 +5 位作者 魏子文 周莹珊 宋厚辉 何海健 董婉玉 王晓杜 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第2期955-964,共10页
旨在探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株细胞适应后的复制特性及致病性,本研究将分离自某规模化猪场的PEDV流行毒株在Vero细胞中连续传代至不同代次,分别评价该毒株在细胞上的生物学特性,并将第25代和第141代病毒接种至3日龄仔猪,以比较... 旨在探究猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株细胞适应后的复制特性及致病性,本研究将分离自某规模化猪场的PEDV流行毒株在Vero细胞中连续传代至不同代次,分别评价该毒株在细胞上的生物学特性,并将第25代和第141代病毒接种至3日龄仔猪,以比较其致病性差异。结果表明:临床病料接种液盲传至第4代时,在Vero细胞上形成PEDV典型合胞体病变;传代至25代时,细胞病变形态与病毒滴度趋于稳定;传代至141代时,病毒滴度显著提高,并诱发更快速的细胞病变效应。间接免疫荧光试验(IFA)可特异性检出PEDV N蛋白表达,序列分析表明该毒株为G2b型。仔猪攻毒试验表明,与亲本低代次毒株(YJH/2017/F25)相比,YJH/2017/F141接种组未出现明显临床症状或组织病理损伤,且肛拭子病毒排放量显著减少,各项指标与DMEM对照组无显著差异,该毒株的致病性较低而具有较好安全性。以上结果说明该流行毒株在体外连续传代后获得了更好的细胞适应性且对新生仔猪的致病性降低,本研究为PEDV弱毒疫苗研发提供新的候选毒株,其全基因组序列和生物学特征也为后续重组病毒研究奠定了基础。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 G2b型 细胞适应毒株 生物学特性
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N-脱乙酰/N-硫酸化酶1对口蹄疫病毒入侵CHO-K1细胞的影响
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作者 郭海洋 蔡梦婷 +12 位作者 袁红 王涛 包慧芳 翁涵 赵俊芳 付元芳 李平花 李坤 孙普 曹轶梅 赵志荀 卢曾军 白兴文 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第2期143-151,共9页
高度硫酸化的硫酸乙酰肝素(HS)作为受体分子调控多种病原体的感染,通过分析HS生物合成修饰酶在病毒入侵中的作用,可以鉴定何种酶催化的反应是HS发挥受体功能的关键。N-脱乙酰/N-硫酸化酶1(NDST1)介导HS的N-硫酸化修饰,本研究分析了NDST... 高度硫酸化的硫酸乙酰肝素(HS)作为受体分子调控多种病原体的感染,通过分析HS生物合成修饰酶在病毒入侵中的作用,可以鉴定何种酶催化的反应是HS发挥受体功能的关键。N-脱乙酰/N-硫酸化酶1(NDST1)介导HS的N-硫酸化修饰,本研究分析了NDST1对口蹄疫病毒(FMDV)入侵CHO-K1细胞的影响。利用蚀斑试验筛选高效感染CHO-K1细胞的FMDV,构建pLOV-NDST1重组质粒以及设计靶向NDST1的特异性siRNA,通过Western-blot和RT-qPCR分析NDST1过表达以及敲低对FMDV复制、吸附和内化的影响。结果表明,FMDV O/NX/92能够明显感染CHO-K1细胞,NDST1过表达显著促进FMDV O/NX/92在CHO-K1细胞中的复制、吸附和内化,特异性siRNA介导的NDST1敲低显著抑制FMDV O/NX/92在CHO-K1细胞中的复制、吸附和内化。本研究在CHO-K1细胞中证实NDST1催化的N-硫酸化修饰可明显增强FMDV的入侵能力,为HS的受体功能机制解析及抗病毒靶点开发提供了理论依据。 展开更多
关键词 NDST1 口蹄疫病毒 硫酸乙酰肝素 入侵
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冠状病毒辅助蛋白功能研究进展
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作者 赵秀美 赵海娜 +3 位作者 华姝 程旭 陈祥 姜逸 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第1期96-107,共12页
冠状病毒RNA基因组由多个开放阅读框组成,除了表达结构蛋白和非结构蛋白外,还可以表达辅助蛋白。冠状病毒辅助蛋白具有种属特异性,不同冠状病毒编码数量不等的辅助蛋白。冠状病毒辅助蛋白不是病毒复制所必需的,但是部分辅助蛋白参与宿... 冠状病毒RNA基因组由多个开放阅读框组成,除了表达结构蛋白和非结构蛋白外,还可以表达辅助蛋白。冠状病毒辅助蛋白具有种属特异性,不同冠状病毒编码数量不等的辅助蛋白。冠状病毒辅助蛋白不是病毒复制所必需的,但是部分辅助蛋白参与宿主免疫反应,在病毒发病机制和病毒毒力中起重要作用。冠状病毒辅助蛋白研究为开发治疗药物提供新的潜在靶点,为疾病预防和治疗提供理论指导。本文对几种具有代表性冠状病毒的辅助蛋白的功能进行综述,重点介绍辅助蛋白与病毒-宿主相互作用的关系,包括辅助蛋白在促进宿主细胞凋亡、宿主天然免疫调节,以及在宿主体内致病性的作用,有助于了解冠状病毒的感染和发病机制,为研制新型疫苗和抗病毒药物提供参考。 展开更多
关键词 冠状病毒 辅助蛋白 细胞凋亡 天然免疫 致病性 疫苗
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基于牛病毒性腹泻病毒核心蛋白C间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 贾东鹭 阮武营 +11 位作者 刘飞飞 李星仪 杨澳飞 尹波 陈慧敏 陈建 魏颖 何雷 余祖华 马雪连 丁轲 陈松彪 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期63-70,共8页
为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检... 为建立基于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)核心蛋白C的间接ELISA检测方法,通过PCR扩增出BVDV C基因,克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组质粒pET-32a-C,经IPTG诱导表达纯化后免疫BABL/c小鼠制备多克隆抗体,以C蛋白为包被抗原,建立间接ELISA检测方法。结果显示,pET-32a-C重组质粒构建成功,重组C蛋白大小约为30 k Da,能够以可溶形式表达,30℃、0.8 mmol/L IPTG诱导6 h可溶性表达最佳;该蛋白免疫BABL/c小鼠后制备血清抗体效价为1∶128000,能够特异性识别C蛋白。该ELISA检测方法的最适条件为:0.5μg/m L抗原37℃包被2 h,10 g/L BSA溶液37℃封闭3 h,1∶16000稀释血清孵育2 h,二抗孵育40 min,避光显色10 min,阴阳性临界值判定标准为0.224,具有良好的特异性和重复性。利用本方法对未免疫接种的疑似BVDV感染的牛血清进行检测,与RT-qPCR核酸检测方法相比,二者阳性符合率达94.73%。上述结果表明,基于C蛋白建立的间接ELISA抗体检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为BVDV临床诊断及开发基于C蛋白的间接ELISA检测试剂盒奠定了基础。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 核心蛋白C 原核表达 多克隆抗体 间接ELISA
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猫传染性腹膜炎病毒对猫免疫功能的影响及甘露消毒丹和虫草素调节机制研究
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作者 郭昊彤 彭佳仪 +3 位作者 宋健 李佳 张倩 陈武 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期1-12,共12页
旨在探究猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)刺激对猫外周血单个核细胞(PBMC)免疫功能及磷酸二酯酶(PDE)相关基因表达的影响,为揭示FIPV引起的相关免疫机制和临床中药治疗积累数据。首先,分离猫PBMC并分为对照组、低浓度FIPV组和高浓度FIPV组。... 旨在探究猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)刺激对猫外周血单个核细胞(PBMC)免疫功能及磷酸二酯酶(PDE)相关基因表达的影响,为揭示FIPV引起的相关免疫机制和临床中药治疗积累数据。首先,分离猫PBMC并分为对照组、低浓度FIPV组和高浓度FIPV组。通过流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)观察FIPV刺激下免疫细胞、免疫球蛋白和一些免疫因子的变化;利用实时荧光定量PCR检测FIPV刺激下不同质量浓度虫草素与甘露消毒丹(GXM)对CRFK细胞和PBMC内的磷酸二酯酶1B(PDE1B)基因、磷酸二酯酶4B(PDE4B)基因相对表达量的影响;通过ELISA检测FIPV刺激下不同质量浓度虫草素与GXM作用后CRFK细胞和PBMC内环磷酸腺苷(cAMP)的含量。结果显示,低浓度的FIPV病毒液对CD4^(+)T细胞表现出一定的抑制作用,高剂量时转为促进作用。随着病毒量的递增,CD8^(+)T细胞受到显著抑制且CD4^(+)/CD8^(+)比值显著增高;FIPV刺激下PBMC表现出显著的免疫球蛋白M水平上调,免疫球蛋白G水平下调;FIPV刺激后,PBMC分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-4增多,白细胞介素-2、白细胞介素-6减少;FIPV能通过下调PDE4B、PDE1B基因的表达来降低cAMP水平,而GXM和虫草素能上调两者的表达水平,促进cAMP恢复正常水平。综上所述,低浓度的FIPV刺激下细胞免疫较强于体液免疫,高浓度FIPV则相反;FIPV能降低PDE4B、PDE1B基因表达水平并减少cAMP的分泌;GXM和虫草素能上调PDE4B、PDE1B基因表达水平并促进cAMP恢复正常水平,有望成为临床猫传染性腹膜炎治疗药物。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎 免疫 PDES 虫草素 甘露消毒丹
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牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及抗原捕获ELISA检测方法的建立
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作者 赵嘉豪 李树凡 +4 位作者 薛凤 王君 张灿 刘文华 徐守振 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期56-62,共7页
为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体及建立抗原捕获ELISA检测方法,采用大肠杆菌原核表达的BVDV Erns截短蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后利用细胞融合和杂交瘤筛选,选用效价高的单克隆抗体,通过条件优化建立BVDV抗原捕获ELISA检测方法... 为了制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体及建立抗原捕获ELISA检测方法,采用大肠杆菌原核表达的BVDV Erns截短蛋白免疫BALB/c小鼠,三免后利用细胞融合和杂交瘤筛选,选用效价高的单克隆抗体,通过条件优化建立BVDV抗原捕获ELISA检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行了验证,并与IDEXX商品化试剂盒及RT-PCR进行临床样品符合。结果显示,获得2株效价较高的Ig G1型单克隆抗体杂交瘤细胞2B3、2B10,轻链均为κ链。选用效价更高的2B10单克隆抗体作为检测抗体,家兔源BVDV多克隆抗体作为捕获抗体,建立的BVDV抗原捕获ELISA与临床常见病原(牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛支原体)无交叉反应,最低可检测102.53TCID50的BVDV病毒液,批内和批间变异系数均低于5%,与IDEXX试剂盒和RT-PCR的总体符合率分别为91.76%~93.33%和94.12%~96.67%。结果表明,基于2B10单克隆抗体建立的BVDV抗原捕获ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BVDV的检测和防控提供了借鉴和技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 Erns蛋白 单克隆抗体 ELISA
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基于CRISPR/Cas9技术构建猪GRSF1基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
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作者 杜鹏飞 彭听雨 +3 位作者 范双旗 郑海学 朱紫祥 陈金顶 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第2期161-167,共7页
利用CRISPR/Cas9技术构建鸟嘌呤富含序列因子1(GRSF1)基因敲除的PK-15细胞并探究GRSF1基因敲除对于细胞活性的影响。首先,设计了4条靶向猪源GRSF1基因的sgRNAs(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4),经退火后与慢病毒载体质粒(Lenti-CRI... 利用CRISPR/Cas9技术构建鸟嘌呤富含序列因子1(GRSF1)基因敲除的PK-15细胞并探究GRSF1基因敲除对于细胞活性的影响。首先,设计了4条靶向猪源GRSF1基因的sgRNAs(sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4),经退火后与慢病毒载体质粒(Lenti-CRISPR v2)连接。随后将构建成功的慢病毒载体与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染人胚胎肾细胞(HEK-293T),获得慢病毒并感染PK-15细胞。最终经嘌呤霉素筛选和梯度稀释法获得GRSF1敲除的PK-15单克隆细胞系。通过Western-blot及测序验证GRSF1的敲除效率,然后进行单克隆细胞活性检测及IL-6水平检测。结果表明,本研究成功获得3株GRSF1基因敲除成功的PK-15单克隆细胞系,并证实GRSF1基因敲除影响PK-15细胞中IL-6表达的上调,为后续研究猪GRSF1的生物学功能提供细胞模型。 展开更多
关键词 GRSF1 PK-15 CRISPR/Cas9 基因敲除
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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30like毒株NSP4蛋白晶体结构及功能解析
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作者 周雨 赵飞帆 +4 位作者 赵贺盛 闫利明 李祥敏 娄智勇 钱平 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第2期922-932,共11页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害全球养猪业的重要病原体,其非结构蛋白NSP4作为3C样丝氨酸蛋白酶(3CLSP),在其他保守的结构域间连接处切割病毒多蛋白,在病毒的转录复制过程中发挥着关键作用。本研究旨在解析NSP4蛋白、结... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重危害全球养猪业的重要病原体,其非结构蛋白NSP4作为3C样丝氨酸蛋白酶(3CLSP),在其他保守的结构域间连接处切割病毒多蛋白,在病毒的转录复制过程中发挥着关键作用。本研究旨在解析NSP4蛋白、结构特征及酶活性,为靶向NSP4的抗病毒小分子药物研发提供理论依据。本研究以PRRSV NADC30 like毒株为研究对象,通过克隆PRRSV nsp4基因至pGEX-6p载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达并纯化获得高纯度蛋白。利用悬滴法筛选结晶条件,结合X射线晶体学技术解析了NSP4的1.47Å高分辨率晶体结构,并通过荧光共振能量转移体外测定其酶活性。结果显示,PRRSV NSP4由三个结构域组成:N端β桶结构域(Ⅰ,残基12-69)、中间β桶结构域(Ⅱ,残基89-153)和C端α/β结构域(Ⅲ,残基159-190)。进一步通过活性位点预测,明确了NSP4的底物结合口袋由Ser-19、Met-20、His-39等关键残基构成,为基于结构的抑制剂设计提供了靶点。体外酶活试验表明,PRRSV NADC30 like毒株NSP4对底物的催化效率Kcat/Km为411.38 L·(mol·s)^(-1),且底物亲和力Km=23.28μmol·L^(-1)。本研究报道了PRRSV NADC30 like毒株NSP4的高分辨率结构及酶动力学特征,为基于结构的抗病毒药物设计与筛选奠定了重要基础。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 非结构蛋白 晶体结构 酶活性
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猫传染性腹膜炎病毒RdRp复合物的表达纯化及酶活性验证
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作者 杨微 卢昀 +4 位作者 张然 张婉婷 任瑞文 蒋红霞 汤有志 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第2期965-978,共14页
猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)的非结构蛋白(non structure protein,NSP)12是RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)核心组分,但其与辅助因子NSP7、NSP8之间的相互作用以及RdRp复合... 猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV)的非结构蛋白(non structure protein,NSP)12是RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)核心组分,但其与辅助因子NSP7、NSP8之间的相互作用以及RdRp复合体的功能尚不清楚。本研究旨在分析NSP12的分子特征,探究其与NSP7、NSP8的相互作用,并验证RdRp复合体的酶活性。首先,采用生物信息学方法预测NSP12的理化性质及结构特征。为探究FIPV RdRp复合物中NSP7、NSP8和NSP12之间的相互作用,构建了pcDNA3.1-Flag-NSP7,pcDNA3.1-HA-NSP8和pcDNA3.1-Myc-NSP12质粒,转染至293T细胞后,利用免疫共沉淀(co-inmunoprecipitation,Co-IP)、蛋白质体外结合(Pull-down)和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测蛋白互作及共定位。其次,利用PCR扩增FIPV的NSP7、NSP8和NSP12基因,并将其分别同源重组至pET-30α载体,构建原核表达重组质粒。进一步优化诱导表达条件,采用镍柱亲和层析纯化蛋白,并通过超滤管浓缩获得RdRp复合物。最后,建立FIPV RdRp体外RNA延伸体系,并基于凝胶方法检测RdRp复合物的酶活性。生物信息学分析表明,NSP12为稳定的亲水性蛋白,包含43.51%的α螺旋、45.02%的无规则卷曲以及90个潜在磷酸化位点。Co-IP、Pull-down和IFA试验证实,在293T细胞中NSP7、NSP8与NSP12之间存在相互作用并发生共定位。原核表达结果显示,NSP7和NSP8蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量为10和23 ku,NSP12则以可溶性蛋白形式表达,相对分子质量为105 ku。酶活性试验结果表明,RdRp复合物能够延伸RNA模板链,而单独的NSP12则无此活性。本研究通过原核表达纯化了FIPV RdRp复合物,并建立了体外酶活性检测体系。首次证实FIPV-DF2毒株的NSP12需与NSP7、NSP8形成复合体才能发挥RdRp功能,为进一步探究FIPV RdRp的生物学功能及开发靶向RdRp的抗病毒药物奠定基础。 展开更多
关键词 猫传染性腹膜炎病毒 RNA依赖性RNA聚合酶 NSP7 NSP8 NSP12 酶活性
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鹅星状病毒ORF2蛋白多克隆抗体制备及鉴定
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作者 赵忠麒 邹蒙蒙 +5 位作者 张芸菁 何丽霞 武松山 张欣欣 杨桂君 李广兴 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第1期368-377,共10页
【目的】采用原核表达系统表达鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)ORF2蛋白,并制备其兔抗多克隆抗体,为该病毒致病机制和诊断方法研究提供物质基础。【方法】构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,并通过PCR和双酶切对重组质粒鉴定后,... 【目的】采用原核表达系统表达鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)ORF2蛋白,并制备其兔抗多克隆抗体,为该病毒致病机制和诊断方法研究提供物质基础。【方法】构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,并通过PCR和双酶切对重组质粒鉴定后,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过IPTG诱导蛋白表达并优化反应条件,获得GAstV ORF2蛋白。利用纯化的GAstV ORF2蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔抗GAstV ORF2多克隆抗体。采用间接ELISA法测定多克隆抗体效价,通过Western blotting和间接免疫荧光(IFA)法检测多克隆抗体的免疫原性和特异性;为了明确GAstV在雏鹅组织中的嗜性和定位,利用制备的多克隆抗体,通过免疫组织化学(IHC)法检测感染雏鹅肝脏和肾脏组织中的病毒分布情况。【结果】PCR和双酶切鉴定表明成功构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,通过原核表达成功获得GAstV ORF2蛋白,纯化后蛋白浓度为1.38 mg/mL。免疫新西兰大白兔后获得兔抗GAstV ORF2蛋白多克隆抗体,其效价达1∶100000。Western blotting结果显示,多克隆抗体与纯化后GAstV ORF2蛋白出现特异性反应条带;IFA结果显示,多克隆抗体与GAstV及真核表达GAstV ORF2蛋白产生特异性反应;IHC检测结果显示,GAstV在感染雏鹅的肝脏与肾脏广泛分布,GAstV特异性表达于实质细胞与炎性细胞的胞浆内。【结论】本研究成功构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-ORF2,并进行体外诱导表达制备了兔抗GAstV ORF2蛋白多克隆抗体,该多克隆抗体效价高、特异性强,可用于GAstV感染雏鹅体内病毒抗原检测。 展开更多
关键词 鹅星状病毒(GAstV) ORF2蛋白 原核表达 多克隆抗体
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猪盖塔病毒Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
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作者 魏炳燕 邢璐璐 +4 位作者 张璞 孙思祺 黄舒怡 刘天龙 董彦君 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期83-89,共7页
为制备猪盖塔病毒(GETV)Cap蛋白多克隆抗体并探索其应用潜力,首先构建pCold-TF-Cap重组质粒,通过0.4 mmol/L IPTG诱导高效表达可溶性TF-Cap融合蛋白。经Ni-NTA亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白纯度较高,BCA法测得蛋白浓度为22 m... 为制备猪盖塔病毒(GETV)Cap蛋白多克隆抗体并探索其应用潜力,首先构建pCold-TF-Cap重组质粒,通过0.4 mmol/L IPTG诱导高效表达可溶性TF-Cap融合蛋白。经Ni-NTA亲和层析纯化后,利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白纯度较高,BCA法测得蛋白浓度为22 mg/m L。以纯化的融合蛋白与佐剂乳化后免疫6~8周龄BALB/c小鼠,成功制备效价达1∶128000的鼠源多克隆抗体。通过Western-blot分析与间接免疫荧光试验(IFA),证实该多克隆抗体能够特异性识别GETV感染的BHK-21细胞内源性Cap蛋白。此外,以制备的多克隆抗体为一抗、酶标羊抗鼠Ig G为二抗,建立了检测GETV感染小鼠脾和肝组织中Cap蛋白的免疫组织化学(IHC)检测方法。结果显示,阳性信号清晰定位于细胞质中,呈现明显的棕色信号。本研究成功制备了特异性强的GETV Cap蛋白多克隆抗体,并建立了配套IHC检测方法,为GETV的基础研究和临床诊断提供了可靠的免疫学工具。 展开更多
关键词 盖塔病毒 CAP蛋白 原核表达 多克隆抗体 免疫组织化学
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猪瘟病毒劫持ESCRT-Ⅲ与VPS4A调控线粒体自噬从而促进病毒复制的机制
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作者 《中国兽医科学》编辑部 周斌(审核) 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期141-142,共2页
猪瘟病毒(CSFV)感染可诱导线粒体自噬。内吞体分选转运复合物(ESCRT)在饥饿诱导的自噬过程中对吞噬泡闭合及自噬体-溶酶体融合起关键调控作用。2025年7月9日,南京农业大学周斌教授带领的研究团队在Autophagy杂志发表了题为“Classical s... 猪瘟病毒(CSFV)感染可诱导线粒体自噬。内吞体分选转运复合物(ESCRT)在饥饿诱导的自噬过程中对吞噬泡闭合及自噬体-溶酶体融合起关键调控作用。2025年7月9日,南京农业大学周斌教授带领的研究团队在Autophagy杂志发表了题为“Classical swine fever virus hijacks ESCRT-Ⅲand VPS4A to promote phagophore closure for accelerat ing mit ophagy”的研究论文,首次证实在CSFV诱导的线粒体自噬过程中,ESCRT-Ⅲ亚基(CHMP1A、CHMP1B和CHMP4B)及AAA-ATP酶VPS4A是CSFV诱导的线粒体自噬中吞噬泡闭合的关键调控因子,揭示了病毒操纵宿主细胞通路的新机制。 展开更多
关键词 自噬体 猪瘟病毒 内吞体分选转运复合体 线粒体自噬 吞噬泡闭合
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基于猪流行性腹泻病毒S蛋白夹心ELISA定量的疫苗质控方法的建立及验证
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作者 张承凤 杜久斌 +4 位作者 曹光辉 陈晓洁 黎明 贺笋 杨延丽 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第2期216-224,共9页
本试验旨在建立一种准确、灵敏的定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的夹心ELISA方法,用于PED疫苗的质量控制。采用重组PEDV全长S蛋白作为标准品,测定家兔源单克隆抗体GC44F3-1和GC32C11-5与PEDV S蛋白标准品的亲和力;优化夹心ELISA条... 本试验旨在建立一种准确、灵敏的定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的夹心ELISA方法,用于PED疫苗的质量控制。采用重组PEDV全长S蛋白作为标准品,测定家兔源单克隆抗体GC44F3-1和GC32C11-5与PEDV S蛋白标准品的亲和力;优化夹心ELISA条件,验证方法的检测线性、检测限、准确性、重复性、稀释平行性及特异性;监测PEDV S蛋白标准品与预包被的ELISA酶标板保存稳定性,验证方法作为质控方法的可行性。制备的PEDV S蛋白纯度>90%,尺寸均一性较好;GC44F3-1和GC32C11-5的结合速率常数k_(on)分别为4.294×10^(5)和9.445×10^(4)(mol/L)^(-1)·s^(-1),二者解离速率常数k_(off)<1×10^(-7)s^(-1),解离常数Kd<10^(-12)mol/L。ELISA最优检测条件为:捕获抗体2μg/m L,检测抗体0.125μg/m L,捕获抗体4℃过夜包被,抗原37℃孵育1 h,检测抗体37℃孵育1 h,Streptavidin-HRP 37℃孵育25 min,37℃显色15 min。方法学验证表明,该方法具有良好的检测线性(R^(2)=0.9993,n=7),检测限为0.098 ng/m L;高、中、低3个浓度的PEDV S蛋白标准品回收率为94.5%~100.2%,加标回收率为84.3%~98.1%;批内和批间检测CV<5%,重复性良好;不同稀释倍数下检测值CV<5%,稀释平行性好;仅对PEDV检测时结果呈阳性,特异性良好。PEDV S蛋白标准品和预包被的ELISA酶标板稳定保存12个月。该方法能够用于不同生产过程样品的检测和不同批次乳化样品的保存稳定性监测。本研究建立的PEDV S蛋白夹心ELISA定量检测方法具有灵敏、准确、稳定等优点,对PED疫苗质量控制具有良好的应用前景。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 S蛋白 双抗体夹心ELISA 疫苗 质量控制
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基于宏转录组测序技术对一例猪繁殖与呼吸综合征病毒多谱系混合感染的鉴定与分析
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作者 陈盼丹 许小龙 +9 位作者 李慧鑫 王良锋 张倩君 董亚娜 苏佳涛 许丹 王衡 龚浪 孙彦阔 秦锋 《畜牧兽医学报》 北大核心 2026年第2期933-944,共12页
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是对中国养猪业造成重大经济损失的病原之一。目前,PRRSV-2在国内占据主导地位,呈现出多谱系共存的复杂态势,增加了防控难度。本研究旨在评估宏转录组测序技术在PRRSV-2多谱系混合感染鉴别诊断中的应用潜... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是对中国养猪业造成重大经济损失的病原之一。目前,PRRSV-2在国内占据主导地位,呈现出多谱系共存的复杂态势,增加了防控难度。本研究旨在评估宏转录组测序技术在PRRSV-2多谱系混合感染鉴别诊断中的应用潜力。通过对四川某猪场采集的1份PRRSV-2阳性血清样品进行宏转录组测序,获得病毒的全基因组序列,并进一步结合遗传进化分析(IQ-TREE)、相似性比对(Megalign)及重组分析(RDP4/SimPlot)深入解析病毒的进化重组特征。结果显示,本研究从单一血清样品中成功鉴定出SC01-2025(15023 bp)、SC02-2025(14954 bp)、SC03-2025(15293 bp)共3株PRRSV-2,它们的进化分群分别属于谱系1.8、谱系3和谱系8.7。其中,SC01-2025为谱系1.8(代表株NADC30)与谱系5(代表株VR2332)的重组株,其全基因组与NADC30株相似性为88.09%,但在NSP3~7、NSP9~12及ORF3区域与VR2332株相似性更高;SC02-2025为三谱系重组株(谱系1.8/3/8.7),该株在NSP2和NSP3区域与NADC30株最相似,在NSP1、NSP7~10与JXA1株最相似,剩下的区域则与QYYZ株最相似;SC03-2025与JXA1-P80疫苗株全基因组相似性达99%,未检测到重组。本研究基于宏转录组测序技术精准识别出1例四川某猪场PRRSV多谱系混合感染,揭示了该猪场疫苗株(JXA1-P80)与野毒株(类NADC30株、类QYYZ株)共存的复杂流行情况,研究结果表明宏转录组测序技术可为PRRSV疫病诊断和监测提供高分辨率技术支撑。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多谱系混合感染 宏转录组测序技术 基因重组
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云南某猪场猪星状病毒4型全基因克隆与序列分析
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作者 徐思 耿娟 +4 位作者 李枝兰 何帅 柴俊 吕念词 张以芳 《动物医学进展》 北大核心 2026年第1期18-25,共8页
为获取云南猪星状病毒4型(PAstV4)阳性样品全基因组序列并分析其遗传特征。对云南地区猪样品进行PAstV4型检测,在此基础上定向设计7对测序引物扩增拼接出PAstV4型云南株(YN01)全基因组序列,进行序列比对并构建系统发生树。基因序列分析... 为获取云南猪星状病毒4型(PAstV4)阳性样品全基因组序列并分析其遗传特征。对云南地区猪样品进行PAstV4型检测,在此基础上定向设计7对测序引物扩增拼接出PAstV4型云南株(YN01)全基因组序列,进行序列比对并构建系统发生树。基因序列分析结果显示:YN01株基因组全长6725 bp,进化树和同源性分析,YN01株与PAstV4在同一分支。全基因核苷酸同源性在74.5%~86%之间,其中与SJZ株同源性最高为86%,与PAstV其他四型的同源性仅为40.9%~49%。ORF2基因编码衣壳蛋白,其核苷酸及编码的氨基酸序列区域差异性较大,1~450 aa较为保守,450~890 aa为高突变区域,YN01在504~1354 nt处与CH株发生重组的现象。YN01株同源性差异提示PAstV不同型间存在较大差异,且重组现象提升该病毒或通过衣壳蛋白突变和重组进行适应进化,全基因组序列扩增为云南地区PAstV起源、进化、遗传多样性及防制提供了科学基础。 展开更多
关键词 猪星状病毒 全基因组序列 遗传进化分析 重组
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猪急性腹泻综合征冠状病毒通过调控细胞胆固醇促进合胞体形成的机制
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作者 《中国兽医科学》编辑部 冯力(审核) 石达(审核) 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期138-139,共2页
猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,其传播特性和致病机制尚未完全解析。2025年6月30日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所冯力团队在m Bio期刊上发表了题为“The swine acute diarrhea syndrome cor... 猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)是近年来新发现的一种猪肠道冠状病毒,其传播特性和致病机制尚未完全解析。2025年6月30日,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所冯力团队在m Bio期刊上发表了题为“The swine acute diarrhea syndrome coronavirus spike protein promotes syncytial formation via upregulation of cellular cholesterol synthesis”的研究文章,从细胞水平上揭示了SADS-CoV通过利用宿主细胞膜的脂质成分参与复制的新机制。 展开更多
关键词 猪急性腹泻综合征冠状病毒 胆固醇 合胞体
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猪繁殖与呼吸综合征病毒生命周期的研究进展 被引量:3
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作者 刘爱军 张传亮 +1 位作者 黄晓兵 周彩琴 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第3期1027-1041,共15页
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以猪呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍为主要特征的传染病,给全球... 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以猪呼吸系统疾病和母猪繁殖障碍为主要特征的传染病,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。然而,PRRS至今仍没有安全有效的疫苗和药物进行防治。全面深入理解PRRSV生命周期可以为PRRS防控提供新的思路。因此,本文在简述PRRSV生命周期的基础上,重点对病毒侵入、复制与转录、翻译及翻译后修饰、组装等过程的研究进展进行综述,以期为PRRSV致病机制及防控研究提供参考。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 入侵 复制和转录 翻译及翻译后修饰 组装
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