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基于重组酶介导恒温核酸扩增技术快速检测犬传染性肝炎方法的建立
1
作者 宋绍征 顾乐盈 +2 位作者 武颖超 于康英 孟雅琴 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 北大核心 2026年第1期140-147,共8页
【目的】建立一种基于重组酶介导恒温核酸扩增(RAA)技术快速检测犬传染性肝炎疾病的方法。【方法】以犬传染性肝炎病原体1型犬腺病毒(CAV-1)的E3基因序列作为靶标序列,设计合成引物和荧光探针,构建重组质粒作为标准品,进行RAA基础检测... 【目的】建立一种基于重组酶介导恒温核酸扩增(RAA)技术快速检测犬传染性肝炎疾病的方法。【方法】以犬传染性肝炎病原体1型犬腺病毒(CAV-1)的E3基因序列作为靶标序列,设计合成引物和荧光探针,构建重组质粒作为标准品,进行RAA基础检测来筛选引物,确立RAA荧光反应体系。应用不同含量(105,104,103,102,10,1,0.1 COPY/μL)的质粒标准品作为模板,进行RAA检测,分析RAA检测的灵敏度;分别以CAV-1、2型犬腺病毒(CAV-2)、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)的基因组作为模板,进行RAA检测,分析RAA检测的特异性;选择同批次和不同批次的质粒标准品作为模板,进行RAA检测,分析RAA检测的重复性。选取经RT-qPCR检测为阳性和阴性的临床血液样本各40份,进行RAA检测,验证2种方法的符合情况。【结果】成功扩增到约419 bp的E3基因;构建了阳性质粒标准品p18TC1,其质量浓度为200 ng/μL,质粒含量为5.74×10^(10)COPY/μL。经筛选确立以CAV-F4/CAV-R3为引物、以CAV-P为探针的RAA荧光反应体系,反应温度恒定为39℃,反应时间为15 min,检测灵敏度为1 COPY/μL,与CAV-2、CPV、CDV、CCV、CPIV等病毒无任何交叉反应,且批内重复试验的变异系数小于1.00%,批间重复试验的变异系数小于2.00%。临床样本检测结果表明,建立的基于RAA的检测方法与RT-qPCR法的符合率为100%。【结论】建立了基于RAA技术的犬传染性肝炎快速检测方法,该方法具有检测快速、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。 展开更多
关键词 犬传染性肝炎 1型犬腺病毒 重组酶 恒温核酸扩增
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犬冠状病毒与犬细小病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立 被引量：1
2
作者 傅宇飞 李传峰 +8 位作者 田传龙 李泽贤 麦嘉迅 程松 刘禹含 孟春春 朱杰 程国锋 刘光清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期75-83,共9页
根据GenBank中犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)已有基因序列设计其对应引物,通过对反应体系和扩增程序的优化,建立了CCoV和CPV双重荧光定量PCR检测方法,评估了其敏感性、特异性和重复性。结果显示,该方法最佳退火温度为60℃,引物浓... 根据GenBank中犬冠状病毒(CCoV)和犬细小病毒(CPV)已有基因序列设计其对应引物,通过对反应体系和扩增程序的优化,建立了CCoV和CPV双重荧光定量PCR检测方法,评估了其敏感性、特异性和重复性。结果显示,该方法最佳退火温度为60℃,引物浓度分别为CCoV 1.0μmol/L和CPV 0.1μmol/L,检测下限均为10~2 copies/μL。批内与批间的变异系数均小于2%。该方法用于检测犬腺病毒(CAV)、犬圆环病毒(CaCV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬流感病毒(CIV)、犬副流感病毒(CPIV)均无特异性扩增。对68份临床样品的检测,结果表明CCoV阳性率为22.0%,CPV阳性率为61.8%,与普通PCR检测结果相比,本研究建立的方法更加灵敏。本研究建立的CCoV和CPV检测方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点,可用于对CCoV和CPV的鉴别诊断。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 犬细小病毒 双重荧光定量PCR 鉴别诊断
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基于评估大熊猫源CDV/CPV病毒样颗粒疫苗抗体的ELISA方法建立及应用
3
作者 李强 邓英 +4 位作者 兰景超 罗娌 孙珊珊 胡洹圆 颜其贵 《云南农业大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期68-77,共10页
【目的】建立2种间接ELISA方法,用于检测大熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)/犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)病毒样颗粒疫苗免疫后的特异性抗体水平。【方法】以大熊猫源CDV为基础材料,构建含有F蛋白和H蛋白主要抗原... 【目的】建立2种间接ELISA方法,用于检测大熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)/犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)病毒样颗粒疫苗免疫后的特异性抗体水平。【方法】以大熊猫源CDV为基础材料,构建含有F蛋白和H蛋白主要抗原表位的原核表达质粒;利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达系统进行表达,获得重组蛋白后进行纯化、透析、复性并检测其反应原性。以FH融合蛋白和大熊猫源CPV VP2蛋白分别作为ELISA包被抗原,优化抗原质量浓度、血清稀释度等检测条件,并进行特异性、敏感性和重复性检验。使用这2种ELISA方法以及商业化CDV/CPV抗体检测试剂盒,检测CDV/CPV病毒样颗粒疫苗免疫犬血清中的特异性抗体含量,并评估二者的符合率。【结果】成功获得分子质量约为35 ku的FH融合蛋白。以FH融合蛋白为包被抗原时,最佳包被质量浓度为8μg/mL,血清最佳稀释度为1∶800;以VP2蛋白为包被抗原时,最佳包被质量浓度为4μg/mL,血清最佳稀释度为1∶400。成功建立了2种用于检测大熊猫源CDV和CPV特异性抗体含量的间接ELISA方法,且其特异性、敏感性及重复性均表现良好,检测灵敏度优于商业化检测试剂盒。【结论】本研究建立的2种间接ELISA方法能够准确反映大熊猫源CDV/CPV病毒样颗粒疫苗的免疫效果,具有较好的临床应用价值。 展开更多
关键词 大熊猫 犬瘟热病毒 犬细小病毒 病毒样颗粒疫苗 ELISA
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犬副流感病毒N蛋白的真核表达及多克隆抗体制备
4
作者 刘敏 程淮 +3 位作者 郑珍珍 张梦思 张贺伟 任静强 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第5期2287-2294,共8页
【目的】通过真核表达系统表达犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)N蛋白,并制备N蛋白多克隆抗体,为后续CPIV N蛋白的鉴定及病毒在生命周期过程中的功能研究提供基础。【方法】构建CPIV N蛋白真核表达质粒pCAGGS-N,经PCR和We... 【目的】通过真核表达系统表达犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus,CPIV)N蛋白,并制备N蛋白多克隆抗体,为后续CPIV N蛋白的鉴定及病毒在生命周期过程中的功能研究提供基础。【方法】构建CPIV N蛋白真核表达质粒pCAGGS-N,经PCR和Western blotting验证质粒功能后,免疫小鼠,制备CPIV N蛋白多克隆抗体;ELISA法测定抗体效价达到理想效价后,终止免疫;通过Western blotting、间接免疫荧光试验对抗体进行鉴定和分析,并测定多克隆抗体的中和活性。【结果】酶切连接、测序验证结果显示,成功构建了CPIV N蛋白真核表达重组质粒pCAGGS-N,且该质粒可在真核细胞中正常转录和翻译;通过DNA免疫成功制备了小鼠抗CPIV N蛋白多克隆抗体,效价为1∶128000。Western blotting结果显示,该抗体可与纯化的CPIV病毒粒子及外源性表达的CPIV N蛋白结合,分子质量约为59 ku。间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别并结合具有空间构象的CPIV N蛋白,但该多克隆抗体不具有病毒中和活性。【结论】本试验成功构建了真核表达质粒pCAGGS-N,并通过DNA免疫方法成功制备了小鼠抗CPIV N蛋白的多克隆抗体,该抗体具有良好的反应性和特异性,但未显示出中和病毒的活性,为进一步研究CPIV N基因的功能及其他细胞免疫学试验提供了研究基础。 展开更多
关键词 犬副流感病毒(CPIV) 核衣壳蛋白 真核表达 DNA免疫 多克隆抗体
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我国犬瘟热病毒的生态学调查研究 被引量：51
5
作者 李金中 夏咸柱 +6 位作者 胡桂学 范志强 邹啸环 武银莲 黄耕 袁书智 乔贵林 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期375-379,共5页
本研究应用电子显微镜技术检查了１７种毛皮动物和野生动物的６７６份材料，从犬、貂、貉、狐、熊、小熊猫、大熊猫、狼、狮、虎、猞猁、金猫等１２种动物病料中，检出含有ＣＤＶ材料４８７份。应用间接ＥＬＩＳＡ、免疫荧光和中和试验... 本研究应用电子显微镜技术检查了１７种毛皮动物和野生动物的６７６份材料，从犬、貂、貉、狐、熊、小熊猫、大熊猫、狼、狮、虎、猞猁、金猫等１２种动物病料中，检出含有ＣＤＶ材料４８７份。应用间接ＥＬＩＳＡ、免疫荧光和中和试验等技术检测了８种动物１５８份血清，其中从犬、狐、小熊猫、虎、金猫，狼等６种动物的１０６份血清中检出了抗ＣＤＶ抗体。应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因探针检查了４种动物的３７份材料，其中有２９份阳性。本研究证实的大熊猫、虎、狮、小熊猫、金猫、猞猁、熊、狼等动物对犬瘟热病毒的感染，丰富了犬瘟热病毒生态学的内容。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 生态学 大熊猫 小熊猫 调查
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犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用 被引量：40
6
作者 李金中 何洪彬 +4 位作者 夏咸柱 殷震 涂长春 金宁一 李佑民 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期180-184,共5页
根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增... 根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定，以此对引物进行的ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，这表明此方法为特异性的。对２７条（只）临床病例和３２份细胞培养物进行检查，并与电子显微镜负染检查结果进行了比较。初步应用研究的结果表明，此方法可用于犬瘟热病毒的临床诊断和实验研究。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 反转录 聚合酶链式反应 诊断
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犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析 被引量：13
7
作者 周洁 李昌文 +3 位作者 张洪英 陈洪岩 李建伟 曲连东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期485-488,共4页
根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因... 根据GenBank中A75/14株犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因,将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHT,用重组质粒pPROEXTMHT-N转化感受态E.coliDH5a细胞,用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白,占菌体总蛋白18%。经Westernblot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性,将表达产物用ProBondTM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应,经琼扩试验测定其效价为1∶16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原,建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 核衣壳蛋白 表达 反应活性 多克隆抗体
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检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用 被引量：21
8
作者 汪招雄 何启盖 +3 位作者 刘丽娜 刘正飞 黄红亮 陈焕春 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期220-225,共6页
以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏... 以猪伪狂犬病病毒(PrV)Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体,纯化的抗PrVIgG为检测抗体,建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为,单克隆抗体576株的包被浓度为12.2μg/mL,IgG的工作浓度为16.0μg/mL,对PrV的检测灵敏度达15.6ng(0.156μg/mL),与乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)和猪流感病毒(SIV)等无交叉反应。批间和批内变异系数较小,分别为6.39%和4.1%。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测,肺和脑PrV抗原检出率最高,其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测,发现二者的符合率可达到77.4%,比PCR敏感。实验结果表明:双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点,可广泛应用于动物组织中PrV的检测。 展开更多
关键词 双抗体夹心间接ELISA 单克隆抗体 猪伪狂犬病毒Ea株
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犬瘟热病毒野毒株H蛋白基因的序列分析 被引量：13
9
作者 何洪彬 李金中 +4 位作者 夏咸柱 黄耕 范泉水 余春 邱薇 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第4期404-407,共4页
对引起长春某犬场犬死亡的犬瘟热病毒（ Ｃ Ｄ Ｖ）野毒株（ Ｌ Ｉ Ｕ）附着或血凝蛋白（ Ｈ）基因进行了全基因序列测定，并与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株作了比较。用 ４ 对引物对 Ｌ Ｉ Ｕ 株进行了 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ... 对引起长春某犬场犬死亡的犬瘟热病毒（ Ｃ Ｄ Ｖ）野毒株（ Ｌ Ｉ Ｕ）附着或血凝蛋白（ Ｈ）基因进行了全基因序列测定，并与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株作了比较。用 ４ 对引物对 Ｌ Ｉ Ｕ 株进行了 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增，将扩增得到的 ４ 个阳性 Ｐ Ｃ Ｒ 片段纯化后直接测序。将所测序列拼接后，去掉侧翼的 Ｆ 基因和 Ｌ 基因序列，得到了 Ｈ蛋白的全基因序列。该基因全长为 １ ９４６ ｂｐ，开放阅读框架（ Ｏ Ｒ Ｆ）始于 ２１～２３ 位的 Ａ Ｔ Ｇ，终止于 １ ８４２～１ ８４４位的 Ｔ Ｇ Ａ，编码 ６０７ 个氨基酸。将 Ｌ Ｉ Ｕ 毒株与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株进行比较，二者 Ｈ 基因核苷酸序列的同源性为 ９１．７％ ，推导的 Ｈ 蛋白氨基酸序列的同源性为 ９０．２％ 。 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株的 Ｈ 蛋白潜在的 Ｎ 联糖基化位点为 ４ 个，而 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白为 ８ 个。糖基化位点的不同可能对 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白的抗原性产生影响。２ 个毒株 Ｈ 蛋白的半胱氨酸残基数目均为 １２ 个，且位置是保守的；疏水性有一定的不同，但推测的穿膜区位置是相同的，位于 ３５～５５ 位氨基酸之间。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 H蛋白基因 序列分析 抗原性 致病性
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CDV和CPV及CCV多重纳米PCR检测方法的建立与应用 被引量：8
10
作者 罗亚坤 刘琪 +4 位作者 蔺文成 王静 周灵 梁琳 崔尚金 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1207-1212,共6页
参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒（CDV）N基因序列、犬细小病毒（CPV）VP2基因序列和犬冠状病毒（CCV）M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV（193 bp）、CDV（500 bp）和CCV（780bp）的多重纳米PCR（nano-mPCR）检测方法... 参考Gen Bank上登录的犬瘟热病毒（CDV）N基因序列、犬细小病毒（CPV）VP2基因序列和犬冠状病毒（CCV）M基因序列的保守型片段分别设计特异性引物,建立了CPV（193 bp）、CDV（500 bp）和CCV（780bp）的多重纳米PCR（nano-mPCR）检测方法,同时考查所建立nano-mPCR检测方法的特异性和敏感性。结果表明,该方法特异性和敏感性良好,对CPV、CDV和CCV的最低核酸检测量分别为1.39×10~2、6.0×10~2和6.7×10~2copies/L,其敏感性比普通PCR高100倍。临床样品的检测结果表明,nano-mPCR的建立为CDV、CPV和CCV的单独或混合感染进行早期快速、灵敏、准确的鉴别诊断提供了新方法。 展开更多
关键词 多重纳米PCR 犬瘟热病毒 犬细小病毒 犬冠状病毒 检测 流行病学
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北京地区犬冠状病毒的分离鉴定及遗传进化分析 被引量：16
11
作者 王静 秦彤 +5 位作者 由欣月 刘畅 史利军 梁琳 李金祥 崔尚金 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期92-98,共7页
采集北京地区宠物医院2~4周龄发生腹泻的幼犬粪便样品,经胶体金和PCR,将其初筛为犬冠状病毒(CCoV)阳性。然后,将其处理液接种于MDCK细胞和CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过形态学观察、RT-PCR鉴定、间接免疫荧光试验... 采集北京地区宠物医院2~4周龄发生腹泻的幼犬粪便样品,经胶体金和PCR,将其初筛为犬冠状病毒(CCoV)阳性。然后,将其处理液接种于MDCK细胞和CRFK细胞,进行连续传代培养,出现特征性细胞病变。通过形态学观察、RT-PCR鉴定、间接免疫荧光试验,证明该分离株为犬冠状病毒,遂将其命名为CCoV BJ02株。针对M基因通过RT-PCR法鉴定分离株的基因型,证明其为CCoV-Ⅱ型。Reed-Muench法测得CCoV BJ02株的TCID50为10^-5.2/100μL。通过绘制一步生长曲线发现,该病毒在48小时左右收毒效果最好。遗传进化分析表明,CCoV BJ02株与日本分离株CCoV fc1株位于同一分支中,同源性最高,有较近亲缘关系。上述研究结果为深入了解北京地区CCoV的流行情况,给犬冠状病毒病的诊断、防治及后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 分离鉴定 进化分析
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伪狂犬病病毒Fa株gI和gp63基因缺失株的构建 被引量：13
12
作者 颜其贵 郭万柱 +2 位作者 余光开 王琴 娄高明 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第6期562-566,共5页
用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将... 用限制性核酸内切酶ＮｃｏＩ消化含有伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）Ｆａ侏ＢａｍＨＩ－７片段的质粒ＰＰＢ７，以低融点琼脂糖回收目的片段，经连接并转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ｄ，获得缺失３ｇＩ和部分ｇｐ６３基因的重组质粒ＰＰＢ７－１。将ＰＲＶＦａ与ＰＰＢ７－１ＤＮＡ共同转染ＰＫ１５单层细胞，待出现５０％以上细胞病变时收获病毒，并以蚀斑法得到纯化重组病毒株，命名为ＰＦＤＩ／Ｄ６３。小鼠试验证实缺失株对小鼠具有一定的免疫原性。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 基因缺失 重组
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犬圆环病毒全基因组克隆与序列分析 被引量：13
13
作者 孙文超 曹慧慧 +5 位作者 郑敏 徐素萍 张红云 韦显凯 苏姣秀 何杰勇 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期429-435,共7页
犬圆环病毒(Dog circovirus,DogCV)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒。为研究DogCV中国流行毒株基因组特性和遗传进化,以犬血清样品提取的DNA为模板,采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列,命名为JZ98/2014。序... 犬圆环病毒(Dog circovirus,DogCV)是近年来新发现的一种哺乳动物圆环病毒。为研究DogCV中国流行毒株基因组特性和遗传进化,以犬血清样品提取的DNA为模板,采用重叠PCR技术首次获得DogCV中国流行毒株的全基因组序列,命名为JZ98/2014。序列分析表明JZ98/2014全基因组长度为2063nt,编码3个主要开放阅读框:ORF V1(Rep蛋白,303个氨基酸)、ORF C1(Cap蛋白,270个氨基酸)和ORF C2(106个氨基酸)。同源性比较显示JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株的全基因组序列同源性为82.1%-89.5%,而Rep和Cap基因同源性分别为82.1%-89.5%和84.6%-89.1%。遗传进化树分析显示,目前世界流行的DogCV存在多个分支,而JZ98/2014与美国、欧洲流行毒株处于不同分支。 展开更多
关键词 犬圆环病毒 基因 进化分析
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犬瘟热病毒强毒株的分离与鉴定 被引量：12
14
作者 田克恭 遇秀玲 +5 位作者 吴娜 隋丽华 任晓明 李俊梅 刘永梅 渠川玫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期151-154,共4页
从病死犬肺、肝和淋巴结分离到２株ＣＤＶ，ＣＤＶ９３０３９和ＣＤＶ９３０４１。消除小牛血清中的干扰因素和３３℃培养是分离成功的主要因素。两株病毒均在Ｖｅｒｏ细胞生长良好，传２～４代毒力稳定，ＣＰＥ产生明显，ＴＣＩＤ５０... 从病死犬肺、肝和淋巴结分离到２株ＣＤＶ，ＣＤＶ９３０３９和ＣＤＶ９３０４１。消除小牛血清中的干扰因素和３３℃培养是分离成功的主要因素。两株病毒均在Ｖｅｒｏ细胞生长良好，传２～４代毒力稳定，ＣＰＥ产生明显，ＴＣＩＤ５０为１０－６．５０～１０－６．７７，明显高于国内外野毒株和弱毒株的毒力效价。人工感染犬死亡率较高，表明该分离株致病力较强，作者推测我国犬群可能存在ＣＤＶ强毒变异株。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 分离 鉴定
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用RT-PCR检测病料中犬瘟热病毒的研究 被引量：14
15
作者 鞠会艳 夏咸柱 +4 位作者 高玉伟 杨松涛 冯娜 王铁城 李彦舫 《吉林农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期317-320,共4页
利用RT-PCR技术检测了来自不同地区水貂、狐狸、貉子和老虎病料中是否存在犬瘟热病毒。根据犬瘟热病毒H和N基因核苷酸序列,设计合成2对引物。利用这2对引物分别对14份病料进行了检测。利用H基因引物从7份病料中扩增出761 bp的核酸片段,... 利用RT-PCR技术检测了来自不同地区水貂、狐狸、貉子和老虎病料中是否存在犬瘟热病毒。根据犬瘟热病毒H和N基因核苷酸序列,设计合成2对引物。利用这2对引物分别对14份病料进行了检测。利用H基因引物从7份病料中扩增出761 bp的核酸片段,利用N基因引物也从同样的7份病料中扩增出586 bp的核酸片段。其余病料的检测结果为阴性。2对引物对病料的检测结果一致。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 RT-PCR 检测
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湖南湘西地区外观健康犬携带狂犬病病毒的调查研究 被引量：22
16
作者 刘浩 江禹 +2 位作者 王莉莉 余兴龙 涂长春 《中国动物检疫》 CAS 北大核心 2007年第9期17-19,共3页
为了解湖南湘西地区外观健康犬携带狂犬病病毒的情况,我们于2005年9月从湘西狂犬病疫点采集38份扑杀的外观健康的犬脑组织,并于2006年1月在湘西农贸市场采集了168份外观健康的犬脑组织。RT-PCR和直接荧光抗体试验(FAT)检测表明共有5份... 为了解湖南湘西地区外观健康犬携带狂犬病病毒的情况,我们于2005年9月从湘西狂犬病疫点采集38份扑杀的外观健康的犬脑组织,并于2006年1月在湘西农贸市场采集了168份外观健康的犬脑组织。RT-PCR和直接荧光抗体试验(FAT)检测表明共有5份犬脑标本为阳性,并用乳鼠脑内接种的方法分离得到了5株狂犬病病毒毒株,分子流行病学分析表明这5株病毒均为野毒。在这5份阳性标本,疫点有4份,检出率为10.5%,市场1份,检出率为0.59%。我们的调查结果表明疫点的外观健康犬携带狂犬病病毒的检出率与国内的其它报道接近,而从市场采集的标本的检出率却要低很多。 展开更多
关键词 湘西 狂犬病病毒 家犬 检测
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犬瘟热病毒野毒株融合蛋白主要功能区基因的变异研究 被引量：13
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作者 李金中 夏咸柱 +3 位作者 殷震 李佑民 涂长春 金宁一 《中国兽医学报》 CAS CSCD 1996年第6期519-526,共8页
根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白（Ｆ）基因的核苷酸序列，设计合成了１０条引物。用１对引物从延吉犬病料中扩增出了含Ｆ２区基因的３１４ｂｐ的片段，除两端引物序列外为２６５ｂｐ，编码８８个氨基酸。它与日本弱毒株（ＣＤＶ－Ｊ... 根据犬瘟热病毒（ＣＤＶ）融合蛋白（Ｆ）基因的核苷酸序列，设计合成了１０条引物。用１对引物从延吉犬病料中扩增出了含Ｆ２区基因的３１４ｂｐ的片段，除两端引物序列外为２６５ｂｐ，编码８８个氨基酸。它与日本弱毒株（ＣＤＶ－Ｊ）、Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株（ＣＤＶ－ＯＮ）、海豹瘟热病毒２型（ＰＤＶ２）、１型（ＰＤＶ１）在核苷酸和氨基酸水平上的同源性，分别为９８．１％和９５．５％、９６．２％和９３．２％、９４．３％和９３．２％、７７．４％和８７．５％。对５份来自不同地区的ＣＤＶ病料的融合区基因片段进行了扩增、克隆和序列分析，其中北京１号犬（ＣＤＶ－Ｂ１）、２号犬（ＣＤＶ－Ｂ２）、沈阳犬（ＣＤＶ－Ｓ）和长春犬（ＣＤＶ－Ｚ）的２８３ｂｐ片段完全相同，而与哈尔滨犬（ＣＤＶ－Ｈ）的该片段有３个核苷酸和２个氨基酸不同。在核苷酸和氨基酸水平，北京犬野毒株等与ＣＤＶ－Ｈ、ＣＤＶ－Ｊ、ＣＤＶ－ＯＮ、ＰＤＶ２、ＰＤＶ１的同源性分别为９８．９％和９７．９％、９７．９％和９５．８％、９６．５％和９７．９％、９３．３％和９８．９％、７７．０％和８４．２％。本研究揭示了ＣＤＶ的流行毒株和相关毒株在融合蛋白上的亲缘关系，进一步证实了ＰＤＶ２? 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 病毒 融合蛋白 基因变异
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犬瘟热病毒小熊猫株附着蛋白基因的序列分析 被引量：12
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作者 何洪彬 李金中 +4 位作者 夏咸柱 黄耕 邱薇 余春 范泉水 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 1999年第6期423-427,共5页
为了从基因水平上研究我们分离的犬瘟热病毒（CDV）。熊猫（LP）毒株与疫苗弱毒Onderstepoort株的差别，本文对LP毒株附着蛋白（H）基因进行了序列测定。我们设计合成了4对引物，对LP株进行了RT-PCR扩增，将扩增得到的4个阳性PCR片段纯... 为了从基因水平上研究我们分离的犬瘟热病毒（CDV）。熊猫（LP）毒株与疫苗弱毒Onderstepoort株的差别，本文对LP毒株附着蛋白（H）基因进行了序列测定。我们设计合成了4对引物，对LP株进行了RT-PCR扩增，将扩增得到的4个阳性PCR片段纯化后，直接进行测序，把所测序列拼接后，去掉侧翼的F基因和L基因序列，得到了H蛋白的全基因序列，该基因全长为1946bp，开放阅读框架（ORF）始于21-23位的ATG，终止于1842-1844位的TGA，编码607个氨基酸。将LP毒株与GenBank中疫苗弱毒Onderstepoort株进行比较，二者H基因核苷酸序列的同源性为92％，推导的H蛋白氨基酸序列的同源性为90％。Onderstepert株的H蛋白潜在的N-联糖基化位点为4个，其中2个位于N末端2／3处（一个位于推测的胞质部分，不能利用），另2个位于蛋白质C末端1／3处，而LP株H蛋白潜在的队联糖基化位点为8个，其中4个与Ondersttepoort的N-联糖基化位点完全相同，但另外4个是疫苗株所不具有的，糖基化位点的不同可能对LP株H蛋白的抗原性产生影响;两个毒株H蛋白的丰胱氨酸残基数目均为12个且位置是保守的;疏水性有一定的变化，但推测的穿膜区位置是相同的，约位于35-55位氨基酸之间。上述结果表明LP和Onderstepoort疫苗株的H蛋白及其基因是存在差别的，至? 展开更多
关键词 小熊猫 犬 瘟热病毒 附着蛋白基因 序列分析
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犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用 被引量：9
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作者 王雷 夏咸柱 +4 位作者 卫广森 扈荣良 刘维全 邹啸环 黄耕 《病毒学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期262-266,共5页
根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180... 根据GenBank报道的犬腺病毒(CAV)和犬细小病毒(CPV)序列,设计两对联合PCR引物,其中一对为CAV-1和CAV-2通用引物,另一对为CPV引物。在建立单项PCR基础上,通过优化Mg2+离子浓度和循环参数等反应条件建立联合PCR,确定联合PCR条件为:96℃180s,96℃30s,56℃30s,72℃80s,30个循环。联合PCR结果显示:CAV-1扩增片段大小为497bp,CAV-2为1019bp,CPV为719bp;细胞和其它相关病毒对照均无扩增带。上述PCR产物经用限制性内切酶酶切和克隆测序,结果均与相应病毒的应有条带和序列相同。敏感性比较试验结果表明,联合PCR比用细胞培养分离病毒敏感。将联合PCR应用于15份CAV和CPV细胞培养物,5份CAV-1、1份CAV-2和3份CPV人工感染犬病料以及30份临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法的结果进行比较,结果显示,联合PCR的检出率和病毒分离结果一致,高于电镜负染和HA/HI试验。以上结果说明:CAV-1/CAV-2和CPV联合PCR不仅具有很好的特异性和敏感性,而且可以在短时间内(2 5h～3h)同时鉴定出上述三种病毒,因此具有良好的实验室诊断和临床应用价值。 展开更多
关键词 犬腺病毒 犬细小病毒 联合PCR方法 实验室诊断
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Real-time PCR和PCR方法快速检测犬细小病毒 被引量：7
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作者 熊炜 李健 +5 位作者 邱璐 高莉华 蒋静 李春阳 黄忠荣 胡永强 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期36-40,共5页
为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法。通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著... 为适应出入境口岸对进出境宠物快速检疫的需要,本研究在建立PCR方法检测犬细小病毒(CPV)的基础上,进一步采用Taqman探针技术建立了快速检测CPV的Real-time PCR方法。通过灵敏度对比试验,证实Real-time PCR方法比PCR方法检测灵敏度显著提高。通过对大量不同采样部位样品的检测证实,本研究建立的Real-time PCR和PCR方法具有较高的可靠性,并可显著提高CPV的阳性检出率。 展开更多
关键词 犬细小病毒 Real—time PCR TAQMAN探针 PCR 犬 犬病
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