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绵羊肺炎支原体诱导羊肺泡巨噬细胞焦亡和凋亡的比例及与感染时间的关系
1
作者 岳筠 刘霞 +3 位作者 盛伊果 李梅 陈静 程振涛 《贵州畜牧兽医》 2026年第1期62-66,共5页
为探究绵羊肺炎支原体(Mo)的感染机制,试验应用支气管灌洗法制备原代羊肺泡巨噬细胞,采用流式细胞术对分离细胞进行鉴定;以Mo感染复数MOI=10∶1感染羊肺泡巨噬细胞,感染时长设为12、24、48 h 3个时间段,运用PCR方法检测感染情况,并设非... 为探究绵羊肺炎支原体(Mo)的感染机制,试验应用支气管灌洗法制备原代羊肺泡巨噬细胞,采用流式细胞术对分离细胞进行鉴定;以Mo感染复数MOI=10∶1感染羊肺泡巨噬细胞,感染时长设为12、24、48 h 3个时间段,运用PCR方法检测感染情况,并设非感染组(细胞+培养基);采用流式细胞术检测Mo感染羊肺泡巨噬细胞的凋亡率和焦亡率,并进行比较。结果:制备的羊肺泡巨噬细胞纯度较高,Mo感染后PCR扩增出540 bp的Mo Hsp-70特异性基因片段,表明Mo已感染羊肺泡巨噬细胞。感染12 h组细胞的焦亡率为(8.3±1.4)%,略高于非感染组细胞的(5.2±0.3)%,但差异不显著(P>0.05);感染24、48 h组细胞的焦亡率分别为(12.9±1.2)%、(30.3±1.5)%,均极显著高于非感染组细胞的(6.0±0.2)%、(7.2±0.1)%(P<0.01)。感染12、24、48 h组细胞的凋亡率分别为(10.0±0.7)%、(15.6±5.0)%、(27.8±1.1)%,均极显著高于非感染组细胞的(1.2±0.2)%、(5.8±0.3)%、(9.2±0.1)%(P<0.01)。感染12、24 h细胞凋亡率[(10.0±0.7)%、(15.6±5.0)%]均高于细胞焦亡率[(8.3±1.4)%、(12.9±1.2)%],感染48 h细胞焦亡率[(30.3±1.5)%]高于细胞凋亡率[(27.8±1.1)%]。结果显示Mo诱导羊肺泡巨噬细胞发生焦亡和凋亡现象呈现时间依赖性,随着时间延长,细胞焦亡率高于细胞凋亡率。结论:Mo感染羊肺泡巨噬细胞后可诱导发生凋亡和焦亡,细胞凋亡率在感染早期12、24 h较高,48 h后细胞焦亡率较高。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 羊肺泡巨噬细胞 细胞凋亡 细胞焦亡
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猪肺炎支原体防控研究进展
2
作者 周宏超 贾佩 《广东畜牧兽医科技》 2026年第1期1-5,共5页
猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种以咳嗽、气喘为主要症状的慢性、消耗性传染性疾病,又称为猪喘气病或猪地方流行性肺炎(Enzootic pneumoniae,EP)。随着集... 猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种以咳嗽、气喘为主要症状的慢性、消耗性传染性疾病,又称为猪喘气病或猪地方流行性肺炎(Enzootic pneumoniae,EP)。随着集约化养殖规模加剧,该病在国内猪场感染率居高不下,Mhp感染后虽然致死率低,但会造成感染猪只死淘率和料肉比升高、日增重降低、生长速度减慢、延长育肥猪出栏时间,严重降低猪群的经济效益。用于Mhp的常规防控措施包含疫苗免疫和抗生素治疗两种措施,Mhp入侵宿主后形成的免疫逃避机制、继发感染及抗生素的耐药性使得疫苗免疫和抗生素治疗效果大打折扣,导致Mhp一旦进入猪群很难难清除。针对该防控难点,该文从Mhp的危害、致病机制、流行病学特点及防控措施四个方面对Mhp感染及防控现状做一综述,以期为该病的防控提供参考依据。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 流行情况 发病机制 疫苗免疫 净化
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牛支原体热休克蛋白GrpE的表达及黏附功能分析 被引量：1
3
作者 张梦婷 尚小粉 +8 位作者 马海云 张立 杨永宁 何肖肖 邢小勇 权国梅 武小椿 包世俊 张志雄 《微生物学报》 北大核心 2026年第1期267-283,共17页
【目的】分析牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)热休克蛋白GrpE的进化保守性与结构特征,解析其亚细胞定位及在介导黏附过程中的生物学特性。【方法】参照Mb PG45株GrpE基因序列(GenBank登录号为CP002188.1)设计引物,构建原核表达载体pET-G... 【目的】分析牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)热休克蛋白GrpE的进化保守性与结构特征,解析其亚细胞定位及在介导黏附过程中的生物学特性。【方法】参照Mb PG45株GrpE基因序列(GenBank登录号为CP002188.1)设计引物,构建原核表达载体pET-GrpE。基于基因测序结果,利用生物信息学方法分析GrpE的同源性、遗传进化、理化性质及结构特征。将重组质粒转化后诱导表达,经镍亲和层析纯化获得重组GrpE蛋白,采用SDS-PAGE分析结果。以重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,采用ELISA测定抗体效价,通过Western blotting检测其免疫原性。利用间接免疫荧光(indirect fluorescent antibody assay,IFA)、ELISA及Western blotting分析GrpE的亚细胞定位;采用IFA和ELISA结合试验验证GrpE的黏附功能。【结果】成功构建原核表达载体pET-GrpE,生物信息学分析发现GrpE序列在Mb内高度保守(相似性达95%以上),该序列编码的蛋白由341个氨基酸组成,无信号肽和跨膜结构,含有潜在N-糖基化位点及磷酸化位点。SDS-PAGE分析显示GrpE成功表达且以可溶性形式存在。利用重组蛋白制备多克隆抗体测得其效价为1:16000,Western blotting结果表明GrpE蛋白具有良好的免疫原性。IFA、ELISA及Western blotting结果显示GrpE定位于菌体胞膜与胞质,但主要分布于膜表面。IFA显示GrpE蛋白多抗血清可抑制Mb对胎牛肺(embryonic bovine lung,EBL)细胞的黏附。结合试验结果表明GrpE蛋白以剂量依赖性方式结合宿主细胞膜蛋白,且该结合可被GrpE蛋白多抗抑制(P<0.001)。【结论】GrpE蛋白是Mb的一种高度保守的新型黏附素,直接参与Mb对宿主细胞的黏附过程,为阐明牛支原体致病机制提供了关键分子靶标。 展开更多
关键词 牛支原体 GrpE蛋白 原核表达 亚细胞定位 黏附特性
原文传递
猪源TRAF3基因编辑细胞系的构建及缺失表型研究
4
作者 邵文华 杨帆 +6 位作者 曹伟军 陈创伟 王伟 郑海学 张伟 朱紫祥 赵宗胜 《中国兽医科学》 北大核心 2026年第1期33-39,共7页
本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TRAF3基因敲除的PK-15细胞模型,该模型为阐明TRAF3在口蹄疫病毒(FMDV)复制中的调控作用提供试验材料。针对猪TRAF3基因的编码区序列,设计并筛选出2条高效特异的单向导RNA(sgRNA),并将其分别克隆至CRISPR... 本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了TRAF3基因敲除的PK-15细胞模型,该模型为阐明TRAF3在口蹄疫病毒(FMDV)复制中的调控作用提供试验材料。针对猪TRAF3基因的编码区序列,设计并筛选出2条高效特异的单向导RNA(sgRNA),并将其分别克隆至CRISPR/Cas9载体pX459中。通过脂质体介导的转染技术将重组质粒导入PK-15细胞后,采用嘌呤霉素梯度筛选和有限稀释法相结合的策略,成功获得单克隆细胞系。采用DNA测序结合蛋白质免疫印迹技术对构建的细胞系进行验证,结果显示,TRAF3基因存在特异性碱基缺失突变,且未检测到相应蛋白表达,由此确认TRAF3基因敲除细胞模型构建成功。为探究该基因缺失对FMDV复制的调控作用,通过Western-blot、实时定量PCR(RT-qPCR)及半数组织培养感染剂量(TCID_(50))等多维度检测发现,TRAF3基因的稳定敲除可增强FMDV的复制能力。本研究结果不仅为阐明TRAF3的生物学功能提供了工具细胞系,更为后续研究该基因在病毒-宿主相互作用中的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 TNF受体关联蛋白3 细胞系 口蹄疫病毒
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基于网络药理学、分子对接和细胞试验探究麻杏石甘汤对牛支原体感染的治疗机制
5
作者 于斋卓 张亮 +4 位作者 陈九 乌志勇 朱阳东 闫滨 杨宏军 《中国畜牧兽医》 北大核心 2026年第2期995-1008,共14页
【目的】借助网络药理学、分子对接及细胞试验深入探究麻杏石甘汤对牛支原体感染的治疗机制,为传统中药的现代化提供科学依据,也为治疗牛支原体感染提供新的策略。【方法】以TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction等生物信息学平台为依... 【目的】借助网络药理学、分子对接及细胞试验深入探究麻杏石甘汤对牛支原体感染的治疗机制,为传统中药的现代化提供科学依据,也为治疗牛支原体感染提供新的策略。【方法】以TCMSP、PubChem、SwissTargetPrediction等生物信息学平台为依托,筛选出麻杏石甘汤各味药物活性成分及相关靶点;通过GeneCards、OMIM数据库获取牛支原体相关疾病的靶点;用STRING数据库构建蛋白-蛋白互作网络,借助Cytoscape 3.9.1软件进行网络拓扑分析,同时用DAVID平台进行GO功能与KEGG通路富集分析;运用PyMOL2.4.0和AutoDockTool 1.5.6软件完成分子对接与可视化。将MDBK细胞分为空白对照组、模型组及低、中、高剂量(2.5、5和10 mg/mL)麻杏石甘汤组,除空白对照组外,其余各组以感染复数为1000的牛支原体PG45感染4 h,清洗后分别更换为含药培养基或完全培养基,继续培养24 h,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中的Ct值及相关炎症因子mRNA表达水平。【结果】网络药理学研究发现,麻杏石甘汤含有134个活性成分,牛支原体相关疾病靶点93个,二者的交集靶点共20个,其中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、半胱天冬酶3(CASP3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)等为关键核心靶点。GO功能富集分析主要涉及RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调控、细胞外空间、细胞质、细胞核、细胞因子活性等;KEGG通路富集分析主要涵盖IL-17、TNF、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)等相关信号通路。分子对接结果表明,麻杏石甘汤的活性成分与关键核心靶点的结合能均<-17.8 kJ/mol,具有良好的结合能力。其中,槲皮素与CASP3结合能最小,为-28.87 kJ/mol。细胞试验结果显示,与模型组相比,各剂量麻杏石甘汤组Ct值均显著升高(P<0.05),显著升高了IL-2、IL-10基因表达量(P<0.05),降低了IL-6、IL-8、TNF-α、IL-17A、CASP3、MMP9、PTGS2基因表达量(P<0.05)。【结论】本研究通过网络药理学预测及细胞试验验证揭示了麻杏石甘汤通过作用于IL-6、TNF、MMP9等靶点,调控炎症因子的分泌,抑制炎症反应,从而发挥抗牛支原体感染作用。 展开更多
关键词 麻杏石甘汤 牛支原体 网络药理学 分子对接
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规模化肉羊养殖场中绵羊肺炎支原体流行病学调查与分析
6
作者 李升文 《现代畜牧兽医》 2026年第2期73-76,共4页
研究旨在了解贵州省毕节地区规模化肉羊养殖场中绵羊肺炎支原体流行情况,于2022—2024年采集规模化养殖场中不同阶段肉羊的病料样本(鼻拭子、咽拭子及死亡肉羊肺脏)共1390份,对采集的病料组织样本进行绵羊支原体检测。结果显示,2022—2... 研究旨在了解贵州省毕节地区规模化肉羊养殖场中绵羊肺炎支原体流行情况,于2022—2024年采集规模化养殖场中不同阶段肉羊的病料样本(鼻拭子、咽拭子及死亡肉羊肺脏)共1390份,对采集的病料组织样本进行绵羊支原体检测。结果显示,2022—2024年采集毕节地区规模化养殖场中不同阶段肉羊检出绵羊肺炎支原体阳性的总样本数为141份,阳性率为10.14%(141/1390);其中2022、2023、2024年阳性率分别为8.05%(36/447)、10.75%(49/456)、11.50%(56/487),呈逐年上升的趋势;经过分析,羔羊、育肥羊、种羊、后备种羊的绵羊肺炎支原体阳性率分别为13.62%(58/426)、8.76%(34/388)、7.28%(19/261)、9.52%(30/315),羔羊、后备种羊的绵羊肺炎支原体阳性率较高;不同季节采集的样本中均有绵羊肺炎支原体阳性结果检出,春季11.35%(53/467)和冬季11.93%(63/528)采集样本的绵羊肺炎支原体阳性率高于夏季5.80%(12/207)和秋季6.91%(13/188)。研究表明,2022—2024年,毕节地区肉羊规模化养殖场中羔羊、后备种羊的绵羊肺炎支原体阳性率较高,春季和冬季绵羊肺炎支原体阳性率均高于夏季和秋季。 展开更多
关键词 肉羊 绵羊肺炎支原体 羊传染性胸膜肺炎 流行病学调查
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猪嗜血支原体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶的原核表达及纯化
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作者 张欣雅 杨雄 +3 位作者 闫安 王潇迪 贺越 宋淇淇 《天津农学院学报》 2026年第1期32-36,共5页
猪嗜血支原体是一种附着于猪红细胞膜表面、游离于血浆中或者寄生于骨髓中的病原微生物,感染以贫血、发热、黄疸等为主要临床症状,急性型致死率高,对畜牧业生产造成巨大的经济损失。支原体依赖糖酵解途径供能,果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA... 猪嗜血支原体是一种附着于猪红细胞膜表面、游离于血浆中或者寄生于骨髓中的病原微生物,感染以贫血、发热、黄疸等为主要临床症状,急性型致死率高,对畜牧业生产造成巨大的经济损失。支原体依赖糖酵解途径供能,果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)是糖酵解途径中的关键酶,展现了许多酶催化功能以外的能力。本研究对猪嗜血支原体果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)进行原核表达及纯化,通过构建重组表达质粒pET28a(+)-FBA,转化Transetta感受态细胞,用IPTG诱导表达,利用Western-blot方法检测表达产物,表达产物通过镍离子亲和层析纯化后,用BCA法测定重组蛋白浓度。结果表明:双酶切鉴定原核表达载体构建成功,并在大肠杆菌表达系统中诱导表达,重组蛋白相对分子质量为31.5 ku,在沉淀和上清中均有表达,经镍离子亲和层析获得了纯度较高的目的蛋白,经透析及超滤处理后,重组蛋白浓度为0.48 mg/mL,且纯度较高,可用于进一步研究FBA在猪嗜血支原体中的作用,是潜在的候选疫苗或药物靶点。 展开更多
关键词 猪嗜血支原体 果糖-1 6-二磷酸醛缩酶 原核表达 纯化
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基于同源重组的猪肺炎支原体p97基因突变株的构建
8
作者 韦艳娜 王吉英 +8 位作者 谢欢 李志强 HASSAN Z.A.Ishag 谢星 徐彬 熊祺琰 冯志新 邵国青 于岩飞 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第3期473-481,共9页
采用pGEM■-T载体作为骨架,通过质粒双酶切和连接以及全基因合成的方法,向载体质粒中插入猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的oriC序列,获得pGEM■-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒,以实现质粒在Mhp中的复制;插入螺原体启动子... 采用pGEM■-T载体作为骨架,通过质粒双酶切和连接以及全基因合成的方法,向载体质粒中插入猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的oriC序列,获得pGEM■-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒,以实现质粒在Mhp中的复制;插入螺原体启动子及嘌呤霉素抗性基因用于重组单克隆的筛选;插入p97的上、下游同源臂用于同源重组的启动;插入大肠杆菌recA基因用于提高同源重组效率。然后,将pGEM■-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒通过电转化或化学转化递送入Mhp中,利用嘌呤霉素抗性基因及p97目的基因进行基因缺失株的筛选。结果显示,构建了一种能够同时在Mhp及大肠杆菌中复制的穿梭质粒pGEM■-Mhp-oriC-p97,该质粒的转化能实现嘌呤霉素基因、recA基因在Mhp中的表达及p97基因的变异,初步获得了p97基因突变株。结果表明,建立了一种利用同源重组原理实现Mhp基因编辑的工具,为Mhp致病机制研究工具的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 基因突变株 p97基因 同源重组
原文传递
绵羊肺腺瘤病毒和梅迪-维斯纳病毒双重实时荧光RPA检测方法的建立
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作者 李慧萍 刘然 +1 位作者 张良 刘淑英 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期695-704,共10页
为建立同时检测绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)和梅迪-维斯纳病毒(MVV)的实时荧光RPA检测方法,本试验基于JSRV env基因和MVV LTR序列的保守区,设计、筛选特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件;对该检测方法进行特异性、灵敏性、重复性评估;... 为建立同时检测绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)和梅迪-维斯纳病毒(MVV)的实时荧光RPA检测方法,本试验基于JSRV env基因和MVV LTR序列的保守区,设计、筛选特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件;对该检测方法进行特异性、灵敏性、重复性评估;利用建立的方法对实验室保存的已确诊为JSRV和MVV混合感染的病肺组织进行检测,并与双重PCR方法平行对比,计算吻合率。结果显示,该方法可在42℃、20 min内完成目标片段的扩增,对于混合感染病肺组织cDNA,JSRV和MVV的最低检测限分别为1ng/μL和10 pg/μL,该方法检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊败血性链球菌(OSS)、牛肠道病毒(BEV)、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、肺炎支原体(MO)等继发反刍动物呼吸道症状的病原时呈阴性;分别以浓度为10 ng/μL和100 ng/μL的模板进行重复性试验,组内变异系数为3.6%~9.3%;实验室保存的JSRV和MVV混合感染病肺组织的检测结果与双重PCR方法的吻合率为100%。本研究成功建立了JSRV和MVV双重实时荧光RPA检测方法,该方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,可用于JSRV和MVV的鉴别诊断及混合感染的快速临床检测。 展开更多
关键词 绵羊肺腺瘤病毒 梅迪-维斯纳病毒 重组酶聚合酶恒温扩增技术 快速检测
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绵羊肺炎支原体黏附素P120_(571aa~703aa)蛋白原核表达及免疫原性分析
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作者 徐春光 杨立霞 +2 位作者 于宝莉 李艳 张月梅 《现代牧业》 2025年第2期24-32,共9页
为了筛选用于研制绵羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗和血清学诊断的候选抗原,试验运用IEDB和ABCpred生物信息学软件,对绵羊肺炎支原体NM2010株P120的B细胞抗原表位进行预测分析。基于P120生物信息学预测结果,以p120优势抗原表位区编码基因... 为了筛选用于研制绵羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗和血清学诊断的候选抗原,试验运用IEDB和ABCpred生物信息学软件,对绵羊肺炎支原体NM2010株P120的B细胞抗原表位进行预测分析。基于P120生物信息学预测结果,以p120优势抗原表位区编码基因为模板人工合成目的基因片段,并克隆到表达载体pET-28a(+)上进行原核表达。表达的重组蛋白进行Western-blot分析,并制作疫苗对兔进行免疫试验。用ELISA方法检测免疫兔血清特异性抗体IgG水平和IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等细胞因子浓度。结果表明:绵羊肺炎支原体NM2010株P120蛋白第540~710位氨基酸区段属于优势抗原表位富集区。以第571~703位氨基酸序列的编码基因为模板,合成的基因序列完全正确,长度为414 bp,表达的P120_(571aa~703aa)重组蛋白相对分子质量为17.2 kDa。菌体超声破碎上清液和沉淀均可在SDS-PAGE凝胶上17.2 kDa处观察到目的条带,主要以包涵体形式存在。P120_(571aa~703aa)可与兔抗Mo NM2010株高免血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。经4次免疫后,兔血清中产生了特异性抗体IgG,抗血清效价为1:128000。与阴性对照组相比,重组蛋白免疫试验组的Th1/Th2类细胞因子含量均极显著升高(P<0.01)。结果表明,P120_(571aa~703aa)重组蛋白可以有效诱导试验动物产生体液免疫和细胞免疫反应,说明P120优势抗原表位区可以作为绵羊支原体性肺炎疫苗的候选蛋白。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 黏附素P120 抗原表位 原核表达 反应原性 免疫原性
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海南省文昌鸡主要养殖地区鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的血清学调查与分析 被引量：2
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作者 薛琛璐 张艳 +3 位作者 刘海隆 晁哲 魏立民 刘光亮 《动物医学进展》 北大核心 2025年第1期62-67,共6页
为探明海南省文昌鸡主要养殖地区鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的感染情况,采集来自海口、文昌、琼海、儋州4个文昌鸡主要养殖地区的13个不同规模鸡场未经MG、MS疫苗免疫的文昌鸡血样1726份,采用酶联免疫吸附试验进行MG、MS血清... 为探明海南省文昌鸡主要养殖地区鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的感染情况,采集来自海口、文昌、琼海、儋州4个文昌鸡主要养殖地区的13个不同规模鸡场未经MG、MS疫苗免疫的文昌鸡血样1726份,采用酶联免疫吸附试验进行MG、MS血清抗体检测。结果显示,MG和MS的抗体总阳性率分别为42.00%和31.75%;4个地区以琼海市的MG抗体阳性率最高,达到68.00%;儋州市的MS抗体阳性率最高,达到36.67%;冬季MG的感染率较高,抗体阳性率达47.48%,夏、秋两季MS的感染率较高,抗体阳性率分别为37.85%和35.87%;成年文昌鸡MG和MS的抗体阳性率高于雏鸡和育成鸡(P<0.05),分别为74.45%和59%;小规模场的MG、MS抗体阳性率最高,分别为54.10%和46.45%;不同养殖类型的文昌鸡以商品代蛋鸡MG的抗体阳性率最高,达到83.33%,商品代肉鸡MS的抗体阳性率最高,达到37.04%。结果表明,海南省文昌鸡主要养殖地区普遍存在MG、MS感染。提示各养殖地区应针对性地加强对文昌鸡MG和MS的防控,以减少疫病发生。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 血清学 文昌鸡 海南省
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绵羊肺炎支原体毒力评价细胞模型的建立 被引量：2
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作者 单依依 刘娜 +7 位作者 程子龙 陈益 王晓楠 张纹纹 李文良 杨蕾蕾 冯志新 刘茂军 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期586-591,共6页
旨在通过检测和分析绵羊肺炎支原体(Mo)感染细胞后的毒力相关指标,建立绵羊肺炎支原体毒力评价细胞模型。本研究使用10^(8)CCU_(50)/m L的5株已知毒力的Mo菌株感染MDBK细胞系,使用IFA和qPCR技术检测Mo菌株的黏附能力;通过倒置显微镜观... 旨在通过检测和分析绵羊肺炎支原体(Mo)感染细胞后的毒力相关指标,建立绵羊肺炎支原体毒力评价细胞模型。本研究使用10^(8)CCU_(50)/m L的5株已知毒力的Mo菌株感染MDBK细胞系,使用IFA和qPCR技术检测Mo菌株的黏附能力;通过倒置显微镜观察细胞病变;使用试剂盒检测细胞活性、细胞毒性百分比和胞内H_(2)O_(2)含量。根据显著性分析结果,对5株Mo菌株进行毒力评价。根据相关性分析结果,筛选细胞感染毒力评价模型中与Mo菌株毒力最相关的毒力评价指标。细胞感染毒力评价模型的结果显示,IK3-3和NJ01株的黏附能力、对细胞活性的损伤作用、对细胞膜完整性的破坏作用、对细胞的介导作用均强于Y98、N3-2F和XLY株。IK3-3和NJ01为强毒力菌株,N3-2F和XLY为中等毒力菌株,Y98为毒力较弱菌株,这与前期感染羊的结果一致。相关性分析结果显示,细胞感染毒力评价模型的各项毒力评价指标均具有可行性,其中,Mo菌株的黏附能力与Mo毒力最具有相关性。本试验建立的Mo菌株的体外毒力评价模型可为研究Mo的致病机制、筛选疫苗候选株提供新的试验平台。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 毒力 细胞感染
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1
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作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪肺炎支原体重组蛋白p46真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
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作者 许世萱 孙亚宁 +5 位作者 邢云瑞 杨苏珍 郭军庆 乔松林 陈鑫鑫 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2025年第6期77-83,共7页
为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被... 为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被抗原,优化反应条件,确定阴性、阳性临界值,建立猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,并对方法的敏感性、稳定性、特异性进行评价。结果显示,p46重组蛋白分子质量大小为48.0 ku,纯度在90%以上,特异性和反应性良好。建立的间接ELISA检测方法最优检测条件为:抗原包被浓度为5μg/mL,采用本实验室封闭液37℃封闭120 min,待检血清1∶50稀释,37℃孵育30 min,二抗稀释度为1∶10000,37℃孵育30 min,TMB室温显色20 min。结果判定标准为:OD 450>0.2887为阳性,OD 450<0.2487为阴性,0.2487≤OD 450≤0.2887为可疑。建立的基于猪肺炎支原体p46蛋白的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,与IDEXX的间接ELISA检测试剂盒检测的阴性、阳性血清符合率分别为100%、93.3%,研究结果为猪肺炎支原体抗体检测和免疫评价提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 p46蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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山东省部分地区种禽场鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体流行病学调查 被引量：1
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作者 王瑶 吴少鹏 +6 位作者 李波 杨晓雪 崔明超 孙淑红 陈静 王苗利 兰邹然 《中国家禽》 北大核心 2025年第5期103-111,共9页
为了解山东省种禽场鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的流行情况,研究采用ELISA和荧光定量PCR方法对2023年采集自山东省46个种禽场的2070份血清、2230份咽/泄殖腔拭子、1160份死胚/弱胚及174份禽舍污水样品进行血清学和病原学检测。... 为了解山东省种禽场鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的流行情况,研究采用ELISA和荧光定量PCR方法对2023年采集自山东省46个种禽场的2070份血清、2230份咽/泄殖腔拭子、1160份死胚/弱胚及174份禽舍污水样品进行血清学和病原学检测。结果显示,该地区MG疫苗免疫场和未免疫场禽血清中MG抗体阳性率分别为67.97%(938/1380)和54.78%(378/690);MS疫苗免疫场和未免疫场禽血清中MS抗体阳性率分别为77.63%(722/930)和82.28%(938/1140);咽/泄殖腔拭子样品中MG核酸阳性率为5.07%,MS核酸阳性率为7.80%;死胚/弱胚样品中MG核酸阳性率为3.62%,MS核酸阳性率为0.52%;在禽舍污水样品中,仅1份检测出MG核酸。研究表明,山东省部分地区种禽场样品中MG和MS抗体检出率较高,核酸阳性率较低,种禽场应继续加强野毒感染防控,并进一步实施科学合理的疫苗接种程序和生物安全措施。 展开更多
关键词 种禽场 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 流行病学调查
原文传递
猪肺炎支原体脂蛋白LppB介导纤毛黏附功能域的鉴定 被引量：1
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作者 叶利颖 刘威 +5 位作者 闫安 周丹娜 杨克礼 高婷 田永祥 宋淇淇 《动物医学进展》 北大核心 2025年第6期1-6,共6页
猪肺炎支原体(Mhp)主要引起地方性肺炎,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。LppB是猪肺炎支原体的毒力因子,与纤毛的黏附和呼吸道定植密切相关,然而其具体的功能域还未见报道。利用生物信息学方法,对LppB可能的串联重复区域、disorder... 猪肺炎支原体(Mhp)主要引起地方性肺炎,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。LppB是猪肺炎支原体的毒力因子,与纤毛的黏附和呼吸道定植密切相关,然而其具体的功能域还未见报道。利用生物信息学方法,对LppB可能的串联重复区域、disorder功能域、抗原表位和高级结构进行了预测;为了保留预测功能域的完整性,将LppB分成了3个截短片段,依次为ΔLppB 27-247、ΔLppB 248-424和ΔLppB 425-604;通过原核表达系统,表达3个截短片段,获得了表达的rΔLppB 27-247、rΔLppB 248-424和rΔLppB 425-604重组蛋白;借助纤毛黏附试验,测定了截短片段黏附纤毛的能力。结果显示,LppB黏附纤毛的功能域主要位于27-247 aa和425-604 aa区域。研究结果丰富了对猪肺炎支原体致病机制的理解。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 LppB 纤毛黏附 功能域
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牛支原体分子伴侣Dnak的原核表达及黏附特性分析 被引量：1
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作者 赵云海 张阳阳 +11 位作者 马海云 王青 何肖肖 刘凯 张钰婷 刘玉东 杨永宁 武小椿 邢小勇 权国梅 张志雄 包世俊 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2868-2878,共11页
旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)分子伴侣Dnak(chaperone protein Dnak)蛋白的免疫原性和黏附特性。根据GenBank中Mb HB0801株Dnak基因设计引物,利用Overlap PCR扩增获得Mb Dnak基因,构建重组质粒pET-Dnak,经双酶切和测序鉴定正... 旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)分子伴侣Dnak(chaperone protein Dnak)蛋白的免疫原性和黏附特性。根据GenBank中Mb HB0801株Dnak基因设计引物,利用Overlap PCR扩增获得Mb Dnak基因,构建重组质粒pET-Dnak,经双酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)并通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔获得抗rDnak血清,利用Western blot、ELISA和间接免疫荧光检测Dnak蛋白的免疫原性以及Dnak蛋白在Mb中的分布。通过补体介导的杀菌试验分析检测rDnak抗血清介导的激活补体杀支原体活性。利用黏附及黏附抑制试验分析Dnak蛋白对宿主细胞的黏附功能。结果表明,重组蛋白rDnak主要以上清可溶形式在大肠杆菌中成功表达,其相对分子质量约为70 ku,具有良好的免疫原性;其多抗血清可有效激活补体杀伤支原体;Dnak蛋白在Mb的细胞膜和细胞质中均存在,是Mb的一种黏附相关蛋白,参与对EBL细胞的黏附。综上,Dnak蛋白是Mb中具有良好免疫原性的黏附相关蛋白,为探究Mb的致病机制奠定基础。 展开更多
关键词 牛支原体 Dnak蛋白 原核表达 黏附 免疫原性
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口蹄疫病毒在宿主细胞增殖及免疫逃逸机制研究进展 被引量：3
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作者 李海洋 高永宇 +8 位作者 李翰文 冯宏盛 鲜钰涵 杨思宇 桑辰君 曹玉蝶 唐越 李子彬 高凤山 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1250-1262,共13页
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一类偶蹄类动物感染的高度接触性传染病。该病传播途径多,速度快,给全球畜牧业带来了巨大的经济损失,因而被世界动物卫生组织(World Organi... 口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一类偶蹄类动物感染的高度接触性传染病。该病传播途径多,速度快,给全球畜牧业带来了巨大的经济损失,因而被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)列为A类动物传染病之首。笔者综述了FMDV基因组结构、增殖及免疫逃逸机制等最新研究进展,揭示了FMDV通过整联蛋白受体和硫酸乙酰肝素受体以及目前尚未发现的第3种“受体”侵入细胞并在宿主中进行复制表达的机制,阐明了FMDV在与宿主的长期共同作用过程中进化出逃避宿主天然免疫的机制,并发现多个结构蛋白和非结构蛋白参与了对天然免疫信号通路活化的抑制。通过对FMDV细胞增殖及免疫逃逸机制的研究,阐明FMDV的致病机制,可为今后提高口蹄疫的防控提供思路。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒(FMDV) 增殖 免疫逃逸 致病机制
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猪肺炎支原体Mhp271蛋白的多克隆抗体制备及在抗猪肺炎支原体感染中的应用 被引量：1
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作者 赵环君 刘桐 +3 位作者 武琪 魏渝坤 辛九庆 潘巧 《生物工程学报》 北大核心 2025年第11期4289-4297,共9页
本研究旨在制备猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)膜蛋白Mhp271的多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb)并系统评价其免疫学特性及潜在应用价值。首先通过PCR技术扩增获得mhp271基因片段(3156 bp),将其克隆至原核表达载体pMAL-... 本研究旨在制备猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)膜蛋白Mhp271的多克隆抗体(polyclonal antibody,pAb)并系统评价其免疫学特性及潜在应用价值。首先通过PCR技术扩增获得mhp271基因片段(3156 bp),将其克隆至原核表达载体pMAL-c5x中构建重组表达质粒pMAL-c5x-mhp271。经PCR鉴定和DNA测序验证正确后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导表达重组Mhp271蛋白(rMhp271)。Western blotting结果显示,rMhp271在160 kDa处呈现特异性条带,表明该重组蛋白成功表达。将纯化的rMhp271蛋白乳化后经3次免疫BALB/c小鼠,并在第3次免疫1周后采血,分离血清获得抗Mhp271蛋白pAb。为评价该pAb的反应原性,建立Mhp体外感染猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)模型,感染12 h后分别采用Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)进行检测。Western blotting结果显示,在Mhp感染的PAMs细胞裂解物中可见118 kDa特异性条带,而未感染对照组未检测到相应条带;IFA检测结果显示,Mhp感染组细胞中出现明显的绿色荧光信号,未感染对照组则无荧光信号。进一步通过体外封闭试验评估抗Mhp271蛋白pAb的抗Mhp感染潜力。将Mhp分别与100倍稀释的抗Mhp271蛋白pAb(实验组)或阴性血清(对照组)预孵育30 min后,接种至PAMs细胞并培养12 h,Taq Man实时荧光定量PCR检测结果显示,实验组Mhp载量较对照组显著降低;IFA检测发现实验组荧光信号强度明显减弱。本研究制备的抗Mhp271蛋白pAb具有良好的反应原性和抗感染活性,可用于Western blotting、IFA等免疫学检测方法。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Mhp271蛋白 原核表达 多克隆抗体
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绵羊咽拭子中牛生殖支原体的分离与鉴定 被引量：1
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作者 安嘉琛 贺乾 +2 位作者 马利 王彬 耿建军 《山西农业科学》 2025年第3期121-127,共7页
为确认绵羊肺炎的病原体中是否存在支原体(Mycoplasma)及其类型,采用分子生物学鉴定和支原体分离培养的方法,对疑似患病绵羊的鼻拭子和咽拭子样本进行检测。在分子生物学检测中,利用支原体特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果证... 为确认绵羊肺炎的病原体中是否存在支原体(Mycoplasma)及其类型,采用分子生物学鉴定和支原体分离培养的方法,对疑似患病绵羊的鼻拭子和咽拭子样本进行检测。在分子生物学检测中,利用支原体特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果证实样本中存在支原体感染。同时,利用改良的Thiaucourt's培养基开展支原体分离培养工作,通过连续传代获得纯化培养物。在固体培养基上,培养物菌落呈现出典型的“煎蛋”形态,经Dienes染色后呈现蓝色,符合支原体形态学特征。为进一步明确菌株类型,通过PCR特异性扩增菌株的16S rRNA序列,并对扩增产物进行测序,将所得序列与GenBank数据库中已知的支原体序列进行比对分析及构建系统进化树。结果显示,该菌株与牛生殖支原体(Mycoplasma bovigenitalium,GenBank:AP017902.1)的16S rRNA基因序列一致性高达99.7%,且在进化树上与多株牛生殖支原体聚于同一分支,确认该菌株属于牛生殖支原体。综上所述,该研究从绵羊的咽拭子中成功分离出1株牛生殖支原体。 展开更多
关键词 绵羊 肺炎 支原体 分子生物学 PCR 牛生殖支原体
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