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基于同源重组的猪肺炎支原体p97基因突变株的构建
1
作者 韦艳娜 王吉英 +8 位作者 谢欢 李志强 HASSAN Z.A.Ishag 谢星 徐彬 熊祺琰 冯志新 邵国青 于岩飞 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第3期473-481,共9页
采用pGEM■-T载体作为骨架,通过质粒双酶切和连接以及全基因合成的方法,向载体质粒中插入猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的oriC序列,获得pGEM■-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒,以实现质粒在Mhp中的复制;插入螺原体启动子... 采用pGEM■-T载体作为骨架,通过质粒双酶切和连接以及全基因合成的方法,向载体质粒中插入猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae,Mhp)的oriC序列,获得pGEM■-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒,以实现质粒在Mhp中的复制;插入螺原体启动子及嘌呤霉素抗性基因用于重组单克隆的筛选;插入p97的上、下游同源臂用于同源重组的启动;插入大肠杆菌recA基因用于提高同源重组效率。然后,将pGEM■-Mhp-oriC-p97重组穿梭质粒通过电转化或化学转化递送入Mhp中,利用嘌呤霉素抗性基因及p97目的基因进行基因缺失株的筛选。结果显示,构建了一种能够同时在Mhp及大肠杆菌中复制的穿梭质粒pGEM■-Mhp-oriC-p97,该质粒的转化能实现嘌呤霉素基因、recA基因在Mhp中的表达及p97基因的变异,初步获得了p97基因突变株。结果表明,建立了一种利用同源重组原理实现Mhp基因编辑的工具,为Mhp致病机制研究工具的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 基因突变株 p97基因 同源重组
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绵羊肺腺瘤病毒和梅迪-维斯纳病毒双重实时荧光RPA检测方法的建立
2
作者 李慧萍 刘然 +1 位作者 张良 刘淑英 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期695-704,共10页
为建立同时检测绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)和梅迪-维斯纳病毒(MVV)的实时荧光RPA检测方法,本试验基于JSRV env基因和MVV LTR序列的保守区,设计、筛选特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件;对该检测方法进行特异性、灵敏性、重复性评估;... 为建立同时检测绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)和梅迪-维斯纳病毒(MVV)的实时荧光RPA检测方法,本试验基于JSRV env基因和MVV LTR序列的保守区,设计、筛选特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件;对该检测方法进行特异性、灵敏性、重复性评估;利用建立的方法对实验室保存的已确诊为JSRV和MVV混合感染的病肺组织进行检测,并与双重PCR方法平行对比,计算吻合率。结果显示,该方法可在42℃、20 min内完成目标片段的扩增,对于混合感染病肺组织cDNA,JSRV和MVV的最低检测限分别为1ng/μL和10 pg/μL,该方法检测小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊败血性链球菌(OSS)、牛肠道病毒(BEV)、传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛副流感病毒3型(BPIV3)、肺炎支原体(MO)等继发反刍动物呼吸道症状的病原时呈阴性;分别以浓度为10 ng/μL和100 ng/μL的模板进行重复性试验,组内变异系数为3.6%~9.3%;实验室保存的JSRV和MVV混合感染病肺组织的检测结果与双重PCR方法的吻合率为100%。本研究成功建立了JSRV和MVV双重实时荧光RPA检测方法,该方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,可用于JSRV和MVV的鉴别诊断及混合感染的快速临床检测。 展开更多
关键词 绵羊肺腺瘤病毒 梅迪-维斯纳病毒 重组酶聚合酶恒温扩增技术 快速检测
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绵羊肺炎支原体黏附素P120_(571aa~703aa)蛋白原核表达及免疫原性分析
3
作者 徐春光 杨立霞 +2 位作者 于宝莉 李艳 张月梅 《现代牧业》 2025年第2期24-32,共9页
为了筛选用于研制绵羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗和血清学诊断的候选抗原,试验运用IEDB和ABCpred生物信息学软件,对绵羊肺炎支原体NM2010株P120的B细胞抗原表位进行预测分析。基于P120生物信息学预测结果,以p120优势抗原表位区编码基因... 为了筛选用于研制绵羊传染性胸膜肺炎亚单位疫苗和血清学诊断的候选抗原,试验运用IEDB和ABCpred生物信息学软件,对绵羊肺炎支原体NM2010株P120的B细胞抗原表位进行预测分析。基于P120生物信息学预测结果,以p120优势抗原表位区编码基因为模板人工合成目的基因片段,并克隆到表达载体pET-28a(+)上进行原核表达。表达的重组蛋白进行Western-blot分析,并制作疫苗对兔进行免疫试验。用ELISA方法检测免疫兔血清特异性抗体IgG水平和IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等细胞因子浓度。结果表明:绵羊肺炎支原体NM2010株P120蛋白第540~710位氨基酸区段属于优势抗原表位富集区。以第571~703位氨基酸序列的编码基因为模板,合成的基因序列完全正确,长度为414 bp,表达的P120_(571aa~703aa)重组蛋白相对分子质量为17.2 kDa。菌体超声破碎上清液和沉淀均可在SDS-PAGE凝胶上17.2 kDa处观察到目的条带,主要以包涵体形式存在。P120_(571aa~703aa)可与兔抗Mo NM2010株高免血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。经4次免疫后,兔血清中产生了特异性抗体IgG,抗血清效价为1:128000。与阴性对照组相比,重组蛋白免疫试验组的Th1/Th2类细胞因子含量均极显著升高(P<0.01)。结果表明,P120_(571aa~703aa)重组蛋白可以有效诱导试验动物产生体液免疫和细胞免疫反应,说明P120优势抗原表位区可以作为绵羊支原体性肺炎疫苗的候选蛋白。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 黏附素P120 抗原表位 原核表达 反应原性 免疫原性
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海南省文昌鸡主要养殖地区鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的血清学调查与分析 被引量：1
4
作者 薛琛璐 张艳 +3 位作者 刘海隆 晁哲 魏立民 刘光亮 《动物医学进展》 北大核心 2025年第1期62-67,共6页
为探明海南省文昌鸡主要养殖地区鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的感染情况,采集来自海口、文昌、琼海、儋州4个文昌鸡主要养殖地区的13个不同规模鸡场未经MG、MS疫苗免疫的文昌鸡血样1726份,采用酶联免疫吸附试验进行MG、MS血清... 为探明海南省文昌鸡主要养殖地区鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的感染情况,采集来自海口、文昌、琼海、儋州4个文昌鸡主要养殖地区的13个不同规模鸡场未经MG、MS疫苗免疫的文昌鸡血样1726份,采用酶联免疫吸附试验进行MG、MS血清抗体检测。结果显示,MG和MS的抗体总阳性率分别为42.00%和31.75%;4个地区以琼海市的MG抗体阳性率最高,达到68.00%;儋州市的MS抗体阳性率最高,达到36.67%;冬季MG的感染率较高,抗体阳性率达47.48%,夏、秋两季MS的感染率较高,抗体阳性率分别为37.85%和35.87%;成年文昌鸡MG和MS的抗体阳性率高于雏鸡和育成鸡(P<0.05),分别为74.45%和59%;小规模场的MG、MS抗体阳性率最高,分别为54.10%和46.45%;不同养殖类型的文昌鸡以商品代蛋鸡MG的抗体阳性率最高,达到83.33%,商品代肉鸡MS的抗体阳性率最高,达到37.04%。结果表明,海南省文昌鸡主要养殖地区普遍存在MG、MS感染。提示各养殖地区应针对性地加强对文昌鸡MG和MS的防控,以减少疫病发生。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 血清学 文昌鸡 海南省
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绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白原核表达及ELISA方法建立 被引量：1
5
作者 陈思宇 张梦洁 +12 位作者 田睿 陈益 刘镝钺 李文良 毛立 程子龙 杨蕾蕾 孙敏 张纹纹 杜改梅 储岳峰 王金泉 刘茂军 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期97-105,共9页
绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF... 绵羊肺炎支原体(Mo)是引起规模化羊场呼吸道病的主要病原,危害严重;快速特异诊断是防控该病的保障。本文旨在建立一种检测Mo血清抗体的间接ELISA方法,利用大肠杆菌的密码子偏好性优化Mo EF-Tu基因序列进行原核表达,纯化出高纯度重组rEF-Tu蛋白,以纯化的rEF-Tu为包被抗原,建立Mo间接ELISA抗体检测方法。结果显示,原核表达的EF-Tu蛋白分子质量约为45.4 kDa,与预期相符;Western blot证实具有良好的反应原性;建立的间接ELISA方法最佳优化条件显示,包被抗原浓度为1.25 mg/L,37℃孵育2 h;封闭条件为30 g/L BSA,37℃孵育1 h;待检血清1∶100稀释,37℃孵育45 min;酶标二抗1∶20000稀释,37℃孵育30 min;底物TMB 37℃避光反应15 min;样品OD450值≥0.296时判定为阳性,OD450值≤0.265时判定为阴性,OD 450值0.265~0.296则判为可疑;组内和组间变异系数均低于10%;用该方法与实验室所建Mo全菌蛋白间接ELISA检测方法对233份血清进行检测,两者特异性为90.70%,敏感性为82.69%,符合率约为87.12%。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法具有良好的敏感性、重复性及特异性,为Mo的临床诊断、抗体监测等提供简单快速的血清学诊断方法,也为Mo抗体检测试剂盒的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 EF-Tu蛋白 原核表达 间接ELISA
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猪肺炎支原体重组蛋白p46真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1
6
作者 许世萱 孙亚宁 +5 位作者 邢云瑞 杨苏珍 郭军庆 乔松林 陈鑫鑫 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2025年第6期77-83,共7页
为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被... 为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被抗原,优化反应条件,确定阴性、阳性临界值,建立猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,并对方法的敏感性、稳定性、特异性进行评价。结果显示,p46重组蛋白分子质量大小为48.0 ku,纯度在90%以上,特异性和反应性良好。建立的间接ELISA检测方法最优检测条件为:抗原包被浓度为5μg/mL,采用本实验室封闭液37℃封闭120 min,待检血清1∶50稀释,37℃孵育30 min,二抗稀释度为1∶10000,37℃孵育30 min,TMB室温显色20 min。结果判定标准为:OD 450>0.2887为阳性,OD 450<0.2487为阴性,0.2487≤OD 450≤0.2887为可疑。建立的基于猪肺炎支原体p46蛋白的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,与IDEXX的间接ELISA检测试剂盒检测的阴性、阳性血清符合率分别为100%、93.3%,研究结果为猪肺炎支原体抗体检测和免疫评价提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 p46蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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绵羊肺炎支原体毒力评价细胞模型的建立 被引量：1
7
作者 单依依 刘娜 +7 位作者 程子龙 陈益 王晓楠 张纹纹 李文良 杨蕾蕾 冯志新 刘茂军 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第5期586-591,共6页
旨在通过检测和分析绵羊肺炎支原体(Mo)感染细胞后的毒力相关指标,建立绵羊肺炎支原体毒力评价细胞模型。本研究使用10^(8)CCU_(50)/m L的5株已知毒力的Mo菌株感染MDBK细胞系,使用IFA和qPCR技术检测Mo菌株的黏附能力;通过倒置显微镜观... 旨在通过检测和分析绵羊肺炎支原体(Mo)感染细胞后的毒力相关指标,建立绵羊肺炎支原体毒力评价细胞模型。本研究使用10^(8)CCU_(50)/m L的5株已知毒力的Mo菌株感染MDBK细胞系,使用IFA和qPCR技术检测Mo菌株的黏附能力;通过倒置显微镜观察细胞病变;使用试剂盒检测细胞活性、细胞毒性百分比和胞内H_(2)O_(2)含量。根据显著性分析结果,对5株Mo菌株进行毒力评价。根据相关性分析结果,筛选细胞感染毒力评价模型中与Mo菌株毒力最相关的毒力评价指标。细胞感染毒力评价模型的结果显示,IK3-3和NJ01株的黏附能力、对细胞活性的损伤作用、对细胞膜完整性的破坏作用、对细胞的介导作用均强于Y98、N3-2F和XLY株。IK3-3和NJ01为强毒力菌株,N3-2F和XLY为中等毒力菌株,Y98为毒力较弱菌株,这与前期感染羊的结果一致。相关性分析结果显示,细胞感染毒力评价模型的各项毒力评价指标均具有可行性,其中,Mo菌株的黏附能力与Mo毒力最具有相关性。本试验建立的Mo菌株的体外毒力评价模型可为研究Mo的致病机制、筛选疫苗候选株提供新的试验平台。 展开更多
关键词 绵羊肺炎支原体 毒力 细胞感染
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山东省部分地区种禽场鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体流行病学调查 被引量：1
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作者 王瑶 吴少鹏 +6 位作者 李波 杨晓雪 崔明超 孙淑红 陈静 王苗利 兰邹然 《中国家禽》 北大核心 2025年第5期103-111,共9页
为了解山东省种禽场鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的流行情况,研究采用ELISA和荧光定量PCR方法对2023年采集自山东省46个种禽场的2070份血清、2230份咽/泄殖腔拭子、1160份死胚/弱胚及174份禽舍污水样品进行血清学和病原学检测。... 为了解山东省种禽场鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的流行情况,研究采用ELISA和荧光定量PCR方法对2023年采集自山东省46个种禽场的2070份血清、2230份咽/泄殖腔拭子、1160份死胚/弱胚及174份禽舍污水样品进行血清学和病原学检测。结果显示,该地区MG疫苗免疫场和未免疫场禽血清中MG抗体阳性率分别为67.97%(938/1380)和54.78%(378/690);MS疫苗免疫场和未免疫场禽血清中MS抗体阳性率分别为77.63%(722/930)和82.28%(938/1140);咽/泄殖腔拭子样品中MG核酸阳性率为5.07%,MS核酸阳性率为7.80%;死胚/弱胚样品中MG核酸阳性率为3.62%,MS核酸阳性率为0.52%;在禽舍污水样品中,仅1份检测出MG核酸。研究表明,山东省部分地区种禽场样品中MG和MS抗体检出率较高,核酸阳性率较低,种禽场应继续加强野毒感染防控,并进一步实施科学合理的疫苗接种程序和生物安全措施。 展开更多
关键词 种禽场 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 流行病学调查
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口蹄疫病毒在宿主细胞增殖及免疫逃逸机制研究进展 被引量：1
9
作者 李海洋 高永宇 +8 位作者 李翰文 冯宏盛 鲜钰涵 杨思宇 桑辰君 曹玉蝶 唐越 李子彬 高凤山 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1250-1262,共13页
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一类偶蹄类动物感染的高度接触性传染病。该病传播途径多,速度快,给全球畜牧业带来了巨大的经济损失,因而被世界动物卫生组织(World Organi... 口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一类偶蹄类动物感染的高度接触性传染病。该病传播途径多,速度快,给全球畜牧业带来了巨大的经济损失,因而被世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)列为A类动物传染病之首。笔者综述了FMDV基因组结构、增殖及免疫逃逸机制等最新研究进展,揭示了FMDV通过整联蛋白受体和硫酸乙酰肝素受体以及目前尚未发现的第3种“受体”侵入细胞并在宿主中进行复制表达的机制,阐明了FMDV在与宿主的长期共同作用过程中进化出逃避宿主天然免疫的机制,并发现多个结构蛋白和非结构蛋白参与了对天然免疫信号通路活化的抑制。通过对FMDV细胞增殖及免疫逃逸机制的研究,阐明FMDV的致病机制,可为今后提高口蹄疫的防控提供思路。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒(FMDV) 增殖 免疫逃逸 致病机制
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大车前苷抑制猪肺炎支原体诱导的炎性反应的作用初探
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作者 王吉英 向书涵 +7 位作者 李志强 李炻漾 张磊 谢青云 熊祺琰 邵国青 冯志新 于岩飞 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第4期1958-1968,共11页
猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae, Mhp)在呼吸道上皮细胞定植,引起猪气管、支气管及肺组织的炎性损伤,使猪饲料转化率降低,日增重下降,给养猪业造成严重的经济损失。大车前苷(Plantamajoside, PMS)为一种常用的抗炎中药,其... 猪肺炎支原体(Mesomycoplasma hyopneumoniae, Mhp)在呼吸道上皮细胞定植,引起猪气管、支气管及肺组织的炎性损伤,使猪饲料转化率降低,日增重下降,给养猪业造成严重的经济损失。大车前苷(Plantamajoside, PMS)为一种常用的抗炎中药,其在抑制Mhp感染引起的炎性反应中的作用未知。本研究拟通过Mhp感染PK-15细胞和小鼠为模型,探讨大车前苷在体外及体内条件下对Mhp诱导的炎性反应的影响及其相关机制。通过不同浓度的PMS作用PK-15细胞,确定PMS对细胞形态和活力无影响的最高浓度。随后采用该最高浓度的PMS的作用于Mhp感染的PK-15细胞,通过RT-qPCR检测PK-15细胞中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等炎性相关因子的mRNA表达变化。结果显示,与细胞对照组相比,Mhp感染组细胞中的IL-6、TNF-α、NF-κB和IκBα的mRNA水平显著升高,而PMS的作用可降低Mhp感染时这种mRNA水平的升高。进一步通过Western blot和免疫荧光分析发现PMS可抑制Mhp诱导的NF-κB P65磷酸化,抑制NF-κB P65的核易位。小鼠感染模型的相关研究发现PMS可改善Mhp诱导的小鼠肺脏病变,使炎性细胞减少。同时,大车前苷可显著降低血清中TNF-α的含量。以上结果表明,PMS可能通过NF-κB通路改善Mhp诱导的炎性反应,为防治猪肺炎支原体感染新方法的提出提供重要的理论依据。 展开更多
关键词 大车前苷(PMS) 猪肺炎支原体(Mhp) 肺炎 核因子-ΚB
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猪肺炎支原体脂蛋白LppB介导纤毛黏附功能域的鉴定
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作者 叶利颖 刘威 +5 位作者 闫安 周丹娜 杨克礼 高婷 田永祥 宋淇淇 《动物医学进展》 北大核心 2025年第6期1-6,共6页
猪肺炎支原体(Mhp)主要引起地方性肺炎,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。LppB是猪肺炎支原体的毒力因子,与纤毛的黏附和呼吸道定植密切相关,然而其具体的功能域还未见报道。利用生物信息学方法,对LppB可能的串联重复区域、disorder... 猪肺炎支原体(Mhp)主要引起地方性肺炎,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。LppB是猪肺炎支原体的毒力因子,与纤毛的黏附和呼吸道定植密切相关,然而其具体的功能域还未见报道。利用生物信息学方法,对LppB可能的串联重复区域、disorder功能域、抗原表位和高级结构进行了预测;为了保留预测功能域的完整性,将LppB分成了3个截短片段,依次为ΔLppB 27-247、ΔLppB 248-424和ΔLppB 425-604;通过原核表达系统,表达3个截短片段,获得了表达的rΔLppB 27-247、rΔLppB 248-424和rΔLppB 425-604重组蛋白;借助纤毛黏附试验,测定了截短片段黏附纤毛的能力。结果显示,LppB黏附纤毛的功能域主要位于27-247 aa和425-604 aa区域。研究结果丰富了对猪肺炎支原体致病机制的理解。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 LppB 纤毛黏附 功能域
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7株奶牛源牛支原体中国分离株的比较基因组学分析
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作者 吴春琳 王梦瑶 +4 位作者 吴雨伦 殳婕 孙学强 潘子豪 姚火春 《南京农业大学学报》 北大核心 2025年第4期892-901,共10页
[目的]本文旨在利用高通量测序技术结合生物信息学方法探究中国部分地区奶牛源牛支原体分离株的基因组多样性和遗传相关性。[方法]通过PCR、测序等技术对中国6个省(自治区)奶牛临床样本进行牛支原体的分离鉴定。结合从NCBI数据库中获取... [目的]本文旨在利用高通量测序技术结合生物信息学方法探究中国部分地区奶牛源牛支原体分离株的基因组多样性和遗传相关性。[方法]通过PCR、测序等技术对中国6个省(自治区)奶牛临床样本进行牛支原体的分离鉴定。结合从NCBI数据库中获取的28株牛支原体基因组,运用生物信息学技术对分离株进行泛基因组分析和系统发育、毒力基因及耐药基因分析。[结果]共分离到7株牛支原体,命名为P-MB1—P-MB7。分离株的基因组全长范围为920~970 kb;含有882~927个编码基因。泛基因组分析结果显示,以上菌株的基因组中共含有2833个基因,核心基因数为474,占比16.7%。核心基因组的系统进化和多位点序列分型(MLST)显示,国内分离株多属于Ⅰ群,ST-52型。毒力基因预测表明,不同分离株均携带7个毒力因子相关基因,涉及黏附、酶、细胞毒性等。此外,共检测到13个耐药基因,其中头孢菌素类和艾法霉素类耐药基因IreK和EF-Tu的携带率最高(100%)。[结论]本研究结果进一步丰富了国内牛支原体流行株的基因组结构、组成和进化信息,也为未来牛支原体适应性进化机制的研究提供了遗传背景资料。 展开更多
关键词 牛支原体 分离鉴定 全基因组学 系统进化分群 毒力基因 耐药基因
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羊支原体肺炎病原三重PCR检测方法的建立
13
作者 吕皓晴 刘颖 +6 位作者 张粟子 刘立元 颜新敏 郝华芳 储岳峰 许健 袁律峰 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第9期1182-1189,共8页
羊支原体肺炎是由多种支原体引起的一类疾病的总称,在我国报道的病原主要包括绵羊肺炎支原体(Mo)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)和丝状支原体山羊亚种(Mmc)等。为了建立一种能够快速鉴别Mo、Mccp、Mmc的方法,本研究通过基因组共线性分... 羊支原体肺炎是由多种支原体引起的一类疾病的总称,在我国报道的病原主要包括绵羊肺炎支原体(Mo)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)和丝状支原体山羊亚种(Mmc)等。为了建立一种能够快速鉴别Mo、Mccp、Mmc的方法,本研究通过基因组共线性分析,鉴定3种羊支原体基因组特异性区间,设计了3种羊支原体特异性引物共计87条,从中筛选出1套三重PCR检测引物,建立了Mo、Mccp、Mmc三重PCR检测方法,对该方法进行优化后,开展特异性、灵敏度试验以及临床样本检测。结果显示,利用筛选出的最适引物组合建立了多重PCR检测方法,能特异性扩增出3个目的条带:Mo(467 bp)、Mccp(668 bp)、Mmc(310 bp),探索出最佳延伸时间和退火温度分别为10 s和56℃,与牛结核分枝杆菌、布鲁氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等其他病原无交叉反应;对构建的阳性标准质粒的最低检测拷贝数分别为10~2copies/μL、10^(1)copies/μL和10^(2)copies/μL。结果表明,本研究建立的三重PCR方法可用于Mo、Mccp、Mmc感染的快速鉴别诊断及流行病学调查,具有临床便捷、诊断快速的特点。 展开更多
关键词 羊支原体肺炎 多重PCR 绵羊肺炎支原体 山羊支原体山羊肺炎亚种 丝状支原体山羊亚种
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鸡毒支原体套式PCR检测方法的建立及初步应用
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作者 周鲁阳 陈学圣 +9 位作者 宋法慧 吴际坤 俞长旭 王傲菲 魏书琦 杨硕 汪建华 张瑞华 姜世金 朱岩丽 《中国家禽》 北大核心 2025年第6期162-168,共7页
为建立一种快速实用的检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的方法,试验根据MG黏附蛋白的mgc2基因序列,选择其保守区域的基因片段,设计两对特异性引物,通过对反应条件和试剂浓度进行优化,建立鸡毒支原体套式PCR检测方法,并应用... 为建立一种快速实用的检测鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)的方法,试验根据MG黏附蛋白的mgc2基因序列,选择其保守区域的基因片段,设计两对特异性引物,通过对反应条件和试剂浓度进行优化,建立鸡毒支原体套式PCR检测方法,并应用该方法检测鸭的临床样品。结果显示,建立的检测方法与其他病原体无交叉反应,特异性良好,MG DNA模板检测限为5×10^(-6) ng/μL,其敏感性是常规PCR的1000倍以上,且批内和批间试验重复性良好;利用该方法对临床病死鸭胚与咽、肛拭子混合样本的检出率分别为10%(5/50)和33%(21/63)。研究表明,建立的MG套式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等优点,适用于鸭群中MG早期感染的检测,为MG的检测和防控及分子流行病学调查提供有力的检测手段。 展开更多
关键词 鸭 鸡毒支原体 套式PCR mgc2
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鸡毒支原体LC株全基因组分析及中国流行株多位点序列分型分析
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作者 方焕新 李琪 +6 位作者 宋子昂 温家明 顾嘉运 王占新 覃健萍 于岩飞 张炜 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第10期5095-5103,共9页
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)感染可引起鸡慢性呼吸道疾病(CRD),影响饲料转化率、产蛋率、孵化率及健苗率,给全球家禽产业造成严重经济损失。本研究旨在分析LC分离株的基因组特性及生物学特征,探索国内流行规律。从孵化厂... 鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)感染可引起鸡慢性呼吸道疾病(CRD),影响饲料转化率、产蛋率、孵化率及健苗率,给全球家禽产业造成严重经济损失。本研究旨在分析LC分离株的基因组特性及生物学特征,探索国内流行规律。从孵化厂中采集啄壳不全活胚进行MG分离,对分离株进行二代基因组测序及黏附相关蛋白变异分析。同时,对国内流行MG菌株进行多位点序列分型(MLST)分析。本研究从孵化厂的啄壳不全活胚中分离到一株MG菌株。基因组分析显示,MG基因组小,仅有953.4 kb,GC含量31.5%。注释显示721个编码区,编码密度89.3%,33个tRNA,2个CRISPR序列。功能富集于翻译、代谢和信号转导,具有高效蛋白质合成和环境适应能力,可能存在与毒力调控的相关基因。在黏附相关蛋白P1、P30和hwm3中发生11处氨基酸突变。MLST分析表明,该分离株属于ST-81型,与国内主要流行的ST-78和ST-36共同构成主要流行基因型。MG已成为孵化厂的重要污染因子,伴随着流行的多样性,显著增加了防控难度。本研究解析了LC株的基因组特征和生物学特性,并分析了国内主要流行ST型,这为病原生物学研究及疫苗菌株筛选提供了科学依据。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 啄壳不全活胚 基因组 氨基酸突变 多位点序列分型
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牛支原体分子伴侣Dnak的原核表达及黏附特性分析
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作者 赵云海 张阳阳 +11 位作者 马海云 王青 何肖肖 刘凯 张钰婷 刘玉东 杨永宁 武小椿 邢小勇 权国梅 张志雄 包世俊 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第6期2868-2878,共11页
旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)分子伴侣Dnak(chaperone protein Dnak)蛋白的免疫原性和黏附特性。根据GenBank中Mb HB0801株Dnak基因设计引物,利用Overlap PCR扩增获得Mb Dnak基因,构建重组质粒pET-Dnak,经双酶切和测序鉴定正... 旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,Mb)分子伴侣Dnak(chaperone protein Dnak)蛋白的免疫原性和黏附特性。根据GenBank中Mb HB0801株Dnak基因设计引物,利用Overlap PCR扩增获得Mb Dnak基因,构建重组质粒pET-Dnak,经双酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)并通过异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔获得抗rDnak血清,利用Western blot、ELISA和间接免疫荧光检测Dnak蛋白的免疫原性以及Dnak蛋白在Mb中的分布。通过补体介导的杀菌试验分析检测rDnak抗血清介导的激活补体杀支原体活性。利用黏附及黏附抑制试验分析Dnak蛋白对宿主细胞的黏附功能。结果表明,重组蛋白rDnak主要以上清可溶形式在大肠杆菌中成功表达,其相对分子质量约为70 ku,具有良好的免疫原性;其多抗血清可有效激活补体杀伤支原体;Dnak蛋白在Mb的细胞膜和细胞质中均存在,是Mb的一种黏附相关蛋白,参与对EBL细胞的黏附。综上,Dnak蛋白是Mb中具有良好免疫原性的黏附相关蛋白,为探究Mb的致病机制奠定基础。 展开更多
关键词 牛支原体 Dnak蛋白 原核表达 黏附 免疫原性
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抗滑液支原体FolD单链抗体的制备及活性鉴定
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作者 何肖肖 张立 +7 位作者 马海云 赵云海 王青 岳亚辉 邢小勇 武小椿 权国梅 包世俊 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期137-144,共8页
旨在制备抗滑液支原体(MS)FolD的小分子单链抗体(ScFv),并对其活性进行鉴定。本研究从分泌抗FolD单克隆抗体杂交瘤细胞中提取总RNA,利用鼠源抗体前导肽和恒定区的通用引物,通过RT-PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),并利... 旨在制备抗滑液支原体(MS)FolD的小分子单链抗体(ScFv),并对其活性进行鉴定。本研究从分泌抗FolD单克隆抗体杂交瘤细胞中提取总RNA,利用鼠源抗体前导肽和恒定区的通用引物,通过RT-PCR扩增得到抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),并利用短肽(Gly4Ser)3连接形成VH-linker-VL,将其插入到表达载体pBAD18-Cm中,转化至E.coli BL21(DE3),经0.15%阿拉伯糖于16℃条件下诱导表达,并利用SDS-PAGE和Western blot分析表达结果,进而利用Western blot和间接ELISA检测ScFv的活性。结果显示,FolD单克隆抗体VH和VL基因大小分别为357 bp和333 bp,应用Linker拼接形成的VH-linker-VL基因大小为753 bp。SDS-PAGE和Western blot结果显示,ScFv在E.coli中以可溶性形式表达,其相对分子质量约为31 kDa。Western blot和ELISA检测结果表明ScFv与抗原FolD有较好的结合活性。本研究成功获得了抗MS FolD的ScFv,为进一步优化ScFv的活性奠定了基础,也为后续研究MS快速检测方法提供生物学材料。 展开更多
关键词 滑液支原体 单链抗体 原核表达 活性鉴定
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GP35蛋白在牛支原体中互作分子的挖掘
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作者 尹号 尤留超 +6 位作者 黄蓉 韩瑞 高鹏程 支飞杰 马轲 付磊 储岳峰 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第2期151-162,共12页
通过在牛支原体中表达GP35蛋白,利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子,将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明,牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白,前者为参与DNA复制过程的重要蛋白,而后者与DNA重组过... 通过在牛支原体中表达GP35蛋白,利用IP-MS筛选其在牛支原体中的互作分子,将互作分子及GP35蛋白进行原核表达后展开互作验证。结果表明,牛支原体中的IP-MS筛选到了SSB蛋白和RmuC蛋白,前者为参与DNA复制过程的重要蛋白,而后者与DNA重组过程相关。完成对GP35、SSB和RmuC蛋白的原核表达后,通过pull-down确定了GP35蛋白与SSB蛋白和RmuC蛋白存在互作关系,结果将有助于解析GP35蛋白在牛支原体中介导重组的机制。 展开更多
关键词 牛支原体 GP35重组酶 互作分子 同源重组
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一种羊肚菌竞争性病害病原菌分离与鉴定
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作者 田爽 朱加楠 +3 位作者 张云志 甄涛 马庆芳 刘佳宁 《黑龙江粮食》 2025年第5期42-44,共3页
本文对黑龙江省肇源县发现的一种羊肚菌的竞争性杂菌病害中的病原菌进行分离鉴定,该病害为黄色子囊菌,分离后与羊肚菌对峙培养时有明显的拮抗线产生,病原菌与羊肚菌竞争栽培环境中的营养及空间,造成羊肚菌减产。经形态学和分子生物学鉴... 本文对黑龙江省肇源县发现的一种羊肚菌的竞争性杂菌病害中的病原菌进行分离鉴定,该病害为黄色子囊菌,分离后与羊肚菌对峙培养时有明显的拮抗线产生,病原菌与羊肚菌竞争栽培环境中的营养及空间,造成羊肚菌减产。经形态学和分子生物学鉴定该病原菌为火丝菌科Pyronemataceae真菌,蛋黄缘刺盘菌Cheilymenia vitellina. 展开更多
关键词 羊肚菌病害 竞争性病害 病原菌 蛋黄缘刺盘菌
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鉴别鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体二重TaqMan实时荧光PCR方法的建立与应用
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作者 梁素联 张江涛 +11 位作者 黄吉丰 辛佳亮 黄晶 唐燕飞 闭璟珊 韦正吉 邹联斌 吴健皓 苏姣秀 杨蓉 粟永春 郑敏 《畜牧业环境》 2025年第15期34-39,共6页
为实现鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的鉴别诊断并满足临床检测需求,针对MG的mgc2基因保守片段和MS的vlhA基因保守片段分别设计特异性引物和TaqMan荧光探针,通过筛选优化反应条件和体系,建立可同时检测MG和MS的二重TaqMan实时荧光... 为实现鸡毒支原体(MG)和鸡滑液囊支原体(MS)的鉴别诊断并满足临床检测需求,针对MG的mgc2基因保守片段和MS的vlhA基因保守片段分别设计特异性引物和TaqMan荧光探针,通过筛选优化反应条件和体系,建立可同时检测MG和MS的二重TaqMan实时荧光PCR方法。结果显示,本试验建立的MG和MS二重TaqMan实时荧光PCR方法对MG阳性质控品最低检出限为2.9827 copies/μL,MS阳性质控品的最低检出限为1.1410 copies/μL,敏感性高;可以特异性扩增支原体MG和MS,与其他禽病原体无交叉反应,特异性强;MG和MS的批间和批内变异系数均小于0.73%,重复性良好。应用本试验建立的检测方法与常规PCR方法同时检测100份临床样品,发现这2种方法的检测结果符合率为100%。表明本试验建立的检测方法在确保敏感性高、特异性强、重复性好的基础上,可实现在一次检测中区分MG和MS,为鸡支原体病的精准防控提供了快捷有效的技术手段。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 二重TaqMan实时荧光PCR
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