目的:诱导脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977对舒达吡啶(sudapyridine,WX-081)的耐药菌株,对其耐药单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因功能注释及相关通路进行初步研究。方法:选取单克隆脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977,采...目的:诱导脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977对舒达吡啶(sudapyridine,WX-081)的耐药菌株,对其耐药单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因功能注释及相关通路进行初步研究。方法:选取单克隆脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977,采用2倍WX-081药物递增液体培养方法筛选耐药菌株。将获得耐WX-081菌株提取DNA并进行全基因组测序,检测SNP。随后,使用Blast软件将所有基因(包含新基因和原有注释基因)与非监督直系群(evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous,eggNOG)、基因本体(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、非冗余数据库(non-redundant,Nr)、蛋白质家族(protein families,Pfam)和注释的蛋白质序列(swiss-prot protein sequence,swiss-prot)等数据库进行序列比对,获得基因的注释信息,建立相应的GO、eggNOG和KEGG数据库。结果:ATCC19977标准株与WX-081耐药ATCC19977菌株相比,编码区共检测到187个SNP,其中62个满足质量标准,43个为纯合SNP,包括12个同义突变和31个错义突变。编码区SNP占9.14%(187/2047),其中获得性终止密码子比例最低,仅为0.05%(1/2047)。非编码区SNP占90.86%(1860/2047),其中基因下游区域、基因上游区域产生SNP占比分别达51.83%(1061/2047)、39.03%(799/2047)。GO注释结果显示,生物学过程(BP)8条,细胞组分(CC)5条,分子功能(MF)4条。eggNOG功能预测显示,7个差异基因功能未知,3个参与氨基酸转运及代谢,1个与核苷酸代谢及转运相关,2个参与脂转运和代谢,1个与转录相关,2个参与细胞壁/细胞膜/包膜生物合成,1个参与翻译后修饰、蛋白质降解、分子伴侣,2个参与无机离子运输与代谢,2个参与次级代谢物生物合成、运输与降解,1个与信号传导功能相关。KEGG通路注释显示,细胞膜转运、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、全局和总览图谱、脂代谢相关通路分别有1条、1条、1条、3条、4条。结论:耐WX-081脓肿分枝杆菌的基因组变异以非编码区SNP为主,编码区31个错义突变可能直接参与耐药。代谢通路分析显示,脂代谢、细胞壁合成及氨基酸转运相关基因显著富集,提示膜/壁结构重塑和代谢重编程是耐药关键机制。耐WX-081脓肿分枝杆菌基因组分析显示,其代谢调控与膜结构相关通路中SNP显著富集。展开更多
应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因mpb70-mpb83后,将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a(+)中...应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因mpb70-mpb83后,将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a(+)中得到重组质粒pET70-83-E6。转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态后,经IPTG诱导以可溶的形式表达融合蛋白。用Ni2+亲合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病阳性血清不反应。用该纯化蛋白初步建立了间接ELISA方法,并检测了117份临床血清样本(其中67份为PPD阳性牛血清),阳性率为39.32%(46/117)份,与PPD皮试诊断的符合率为82.05%(96/117)。展开更多
文摘目的:诱导脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977对舒达吡啶(sudapyridine,WX-081)的耐药菌株,对其耐药单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)基因功能注释及相关通路进行初步研究。方法:选取单克隆脓肿分枝杆菌标准株ATCC19977,采用2倍WX-081药物递增液体培养方法筛选耐药菌株。将获得耐WX-081菌株提取DNA并进行全基因组测序,检测SNP。随后,使用Blast软件将所有基因(包含新基因和原有注释基因)与非监督直系群(evolutionary genealogy of genes:non-supervised orthologous,eggNOG)、基因本体(gene ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、非冗余数据库(non-redundant,Nr)、蛋白质家族(protein families,Pfam)和注释的蛋白质序列(swiss-prot protein sequence,swiss-prot)等数据库进行序列比对,获得基因的注释信息,建立相应的GO、eggNOG和KEGG数据库。结果:ATCC19977标准株与WX-081耐药ATCC19977菌株相比,编码区共检测到187个SNP,其中62个满足质量标准,43个为纯合SNP,包括12个同义突变和31个错义突变。编码区SNP占9.14%(187/2047),其中获得性终止密码子比例最低,仅为0.05%(1/2047)。非编码区SNP占90.86%(1860/2047),其中基因下游区域、基因上游区域产生SNP占比分别达51.83%(1061/2047)、39.03%(799/2047)。GO注释结果显示,生物学过程(BP)8条,细胞组分(CC)5条,分子功能(MF)4条。eggNOG功能预测显示,7个差异基因功能未知,3个参与氨基酸转运及代谢,1个与核苷酸代谢及转运相关,2个参与脂转运和代谢,1个与转录相关,2个参与细胞壁/细胞膜/包膜生物合成,1个参与翻译后修饰、蛋白质降解、分子伴侣,2个参与无机离子运输与代谢,2个参与次级代谢物生物合成、运输与降解,1个与信号传导功能相关。KEGG通路注释显示,细胞膜转运、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、全局和总览图谱、脂代谢相关通路分别有1条、1条、1条、3条、4条。结论:耐WX-081脓肿分枝杆菌的基因组变异以非编码区SNP为主,编码区31个错义突变可能直接参与耐药。代谢通路分析显示,脂代谢、细胞壁合成及氨基酸转运相关基因显著富集,提示膜/壁结构重塑和代谢重编程是耐药关键机制。耐WX-081脓肿分枝杆菌基因组分析显示,其代谢调控与膜结构相关通路中SNP显著富集。
文摘应用PCR方法从牛分枝杆菌Vallee株基因组中扩增获得mpb70、mpb83和esat-6三个目的基因片段。采用重叠延伸剪接技术(splicing by overlap extension,SOE)获得融合基因mpb70-mpb83后,将mpb70-mpb83和esat-6串连于同一表达载体pET32a(+)中得到重组质粒pET70-83-E6。转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态后,经IPTG诱导以可溶的形式表达融合蛋白。用Ni2+亲合层析的方法纯化该融合蛋白。Western blot分析显示:该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病阳性血清不反应。用该纯化蛋白初步建立了间接ELISA方法,并检测了117份临床血清样本(其中67份为PPD阳性牛血清),阳性率为39.32%(46/117)份,与PPD皮试诊断的符合率为82.05%(96/117)。
