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基于CRISPR-Cas系统的多重耐药菌防治技术研究进展 被引量:1
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作者 周倩 唐梦君 +4 位作者 张小燕 陆俊贤 唐修君 杨星星 高玉时 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期42-51,共10页
动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地... 动物源细菌耐药性影响动物养殖安全,同时对人类公共卫生和食品安全产生重要威胁。抗生素的滥用加剧了耐药细菌的传播,而新型抗菌药物研发日益困难,动物源细菌耐药污染已成为全球范围内的公共危机,一旦耐药菌从动物向人类扩散,将极大地威胁人类健康,亟须新的方法和策略应对细菌耐药。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR-associated)是第三代“基因组定点编辑技术”,该技术能够靶向剪切外源性核酸,保护微生物遗传物质遗传稳定性。与传统的多重耐药菌防治策略相比,CRISPR-Cas系统具备独特的DNA序列的靶向性和灵敏度,通过精准、简便和高效的基因编辑技术,与核酸扩增技术、比色技术等相结合,可以提高灵敏度和检测时效性等性能指标。本文介绍了CRISPR-Cas系统的由来、系统分类、基因编辑的作用机理,在此基础之上,聚焦于该系统在多重耐药菌防治领域的研究进展和应用,在耐药致病菌消除、耐药基因消除以及致病菌诊断检测方面给出案例分析以及目前存在的挑战。总的来说,基于CRISPR-Cas系统的序列特异性抗菌剂能够降低细菌多重耐药性,结合核酸扩增技术和实时监控设备提升检测的精准性和效率,为动物源细菌耐药防控和监测研究提供了新思路。 展开更多
关键词 CRISPR-Cas系统 基因编辑 多重耐药菌 耐药基因 防治技术
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热休克蛋白100家族ClpL对猪链球菌2型应激和致病性的影响 被引量:1
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作者 祝昊丹 王锐 +4 位作者 周俊明 王丹丹 胡屹屹 倪艳秀 李彬 《微生物学通报》 北大核心 2025年第2期668-678,共11页
【背景】酪蛋白水解蛋白酶L(caseinolytic protease L,ClpL)是热休克蛋白100(heat shock protein 100,HSP100)家族成员,参与多种细胞内生物学过程包括应激耐受反应、长期存活、毒力和抗生素抗性等,在病原菌的致病过程中发挥重要作用。... 【背景】酪蛋白水解蛋白酶L(caseinolytic protease L,ClpL)是热休克蛋白100(heat shock protein 100,HSP100)家族成员,参与多种细胞内生物学过程包括应激耐受反应、长期存活、毒力和抗生素抗性等,在病原菌的致病过程中发挥重要作用。【目的】阐明HSP100/ClpL对猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)强毒株的应激耐受和毒力的影响。【方法】利用温敏自杀质粒pSET4s构建了SsClpL基因缺失株ΔclpL;利用大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒pSET2构建了互补株CΔclpL;比较亲本株SS2-1、ΔclpL和CΔclpL在各种应激环境(高温、氧化性应激和酸应激)和血液中的生存能力;利用小鼠感染模型和体内竞争试验评价clpL缺失前后细菌的毒力变化。【结果】clpL缺失后,SS2在各种应激环境中的生存能力明显减弱;同时在猪全血中的存活能力也显著降低;对BALB/c小鼠的致病力有所降低,在体内的定殖能力明显降低。【结论】SsClpL与猪链球菌的应激耐受和致病性密切相关。 展开更多
关键词 猪链球菌2型 热休克蛋白100家族ClpL 应激耐受 致病性
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信阳地区鹅源大肠杆菌的分离鉴定、系统进化分群与耐药性分析 被引量:1
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作者 李迎晓 方燕子 +2 位作者 武娴 曲哲会 焦凤超 《黑龙江畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期82-93,共12页
为了解信阳地区鹅源大肠杆菌的系统进化分群、毒力基因携带情况和耐药情况,试验从信阳地区部分养殖户送检的46只疑似大肠杆菌感染病鹅的肝脏、脾脏等组织中进行大肠杆菌的分离、鉴定,并对分离菌株进行系统进化分群、毒力基因检测、耐药... 为了解信阳地区鹅源大肠杆菌的系统进化分群、毒力基因携带情况和耐药情况,试验从信阳地区部分养殖户送检的46只疑似大肠杆菌感染病鹅的肝脏、脾脏等组织中进行大肠杆菌的分离、鉴定,并对分离菌株进行系统进化分群、毒力基因检测、耐药性分析、耐药基因检测。结果表明:共分离到23株大肠杆菌,分别命名为GE1~GE23。23株大肠杆菌在4种系统进化群中均有一定比例的分布,其中A群有3株(GE11、GE12、GE19,占比为13.04%),B1群有3株(GE4、GE15、GE23,占比为13.04%),B2群有9株(GE1、GE2、GE8、GE10、GE14、GE16、GE17、GE20、GE21,占比为39.13%),D群有8株(GE3、GE5、GE6、GE7、GE9、GE13、GE18、GE22,占比为34.78%)。在毒力基因检测中,23株大肠杆菌marA、fimC、fyuA、iroN、iss、hlyF、ompT、iutA和irp2基因的检出率分别为100%、95.65%、52.17%、47.83%、43.48%、39.13%、34.78%、30.43%和17.39%。23株分离菌对阿莫西林/克拉维酸钾的耐药率最高,为65.22%;然后依次为磺胺甲口恶唑/甲氧苄啶、强力霉素、氟苯尼考、多黏毒素B、头孢噻呋和左氧氟沙星、环丙沙星,耐药率分别为56.52%、52.17%、47.83%、34.78%、17.39%和17.39%、8.70%。23株分离菌对亚胺培南的敏感率最高,为100%;然后依次为丁胺卡那、链霉素、新霉素、环丙沙星和左氧氟沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、多黏菌素B、强力霉素、磺胺甲口恶唑/甲氧苄啶,敏感率分别为82.61%、82.61%、47.83%、47.83%和47.83%、34.78%、26.09%、21.74%、17.39%、8.70%。23株分离菌中有12株表现为多重耐药,其中6,7耐菌株各有1株,占比为4.35%;4,5耐菌株各有3株,占比为13.04%;3耐菌株有4株,占比为17.39%。在耐药基因检测中,tetA基因的检出率最高,为82.61%;然后依次为folR、sul2、aadA、bla_(TEM)、bla_(CTX-M)、aphA1、clmA、sul3、sul1、aphA2,检出率分别为73.91%、65.22%、56.32%、52.17%、47.83%、47.83%、43.48%、26.09%、13.04%和13.04%。说明信阳地区鹅源大肠杆菌B2群和D群占比较大,携带多种毒力基因和耐药基因,且多表现为多重耐药。 展开更多
关键词 大肠杆菌 系统进化分群 毒力基因 耐药性 耐药基因
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2012—2024年我国部分地区禽源沙门氏菌耐药情况研究进展 被引量:2
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作者 罗丹丹 鲁志平 +3 位作者 文永平 邬旭龙 吴翠蓉 俞宁 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期178-193,共16页
沙门氏菌是肠杆菌科中具有重要公共卫生意义的人兽共患病原菌,受沙门氏菌污染的禽类制品是人感染沙门氏菌最主要的来源之一。在农业和医疗领域,随着抗菌药物长期使用甚至滥用、沙门氏菌耐药基因的传播以及环境和宿主因素的变化,导致沙... 沙门氏菌是肠杆菌科中具有重要公共卫生意义的人兽共患病原菌,受沙门氏菌污染的禽类制品是人感染沙门氏菌最主要的来源之一。在农业和医疗领域,随着抗菌药物长期使用甚至滥用、沙门氏菌耐药基因的传播以及环境和宿主因素的变化,导致沙门氏菌的耐药性每年都在发生变化。因此,本文就2012—2024年国内外发表的关于我国禽源沙门氏菌耐药性文献作一综述,以期了解沙门氏菌在不同地区不同年份耐药性变化情况,从而为指导临床合理用药和控制疾病流行提供科学依据。 展开更多
关键词 沙门氏菌 禽源 耐药性
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猪源致病性大肠杆菌bla_(CTX-M-123)基因的传播特性和适应性代价研究 被引量:1
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作者 李琼 胡紫微 +4 位作者 金钢铸 陈峥 刘伟成 韩生义 许春燕 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第6期2884-2892,共9页
【目的】阐明猪源大肠杆菌中bla_(CTX-M-123)基因的位置,同时探究其携带的移动遗传元件的传播能力与适应性代价。【方法】通过化学转化试验评估bla_(CTX-M-123)基因的种内转移能力,并利用全基因组测序确定bla_(CTX-M-123)基因的位置,分... 【目的】阐明猪源大肠杆菌中bla_(CTX-M-123)基因的位置,同时探究其携带的移动遗传元件的传播能力与适应性代价。【方法】通过化学转化试验评估bla_(CTX-M-123)基因的种内转移能力,并利用全基因组测序确定bla_(CTX-M-123)基因的位置,分析大肠杆菌中bla_(CTX-M-123)基因的遗传环境;使用微量肉汤稀释法测定大肠杆菌911菌株、大肠杆菌DH5α感受态细胞及转化子的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。此外,通过竞争试验评估携带bla_(CTX-M-123)基因质粒的适应性代价,并使用大蜡螟感染模型进行致病性评价。【结果】通过转化试验得到了1株转化子DH5α-pL1,其对头孢噻呋的MIC值为256μg/mL,生长速率高于受体菌大肠杆菌DH5α感受态细胞,但低于野生型菌株911。DH5α-pL1在培养7 d后,质粒留存率逐渐下降,培养24 h后表现出一定的适应性代价,相对竞争指数<1。致病性试验结果显示,对照组及大肠杆菌DH5α感受态细胞组大蜡螟幼虫存活率为100%;注射菌株911和DH5α-pL1 120 h后,幼虫存活率分别为50%和70%。【结论】携带bla_(CTX-M-123)基因的质粒可在种内转移并介导转化子耐药,且该质粒的稳定性弱,具有一定的适应性代价。此外,携带bla_(CTX-M-123)基因的质粒具有增强受体菌致病力的作用,增加了感染的几率和治疗难度。研究结果为细菌的耐药机制研究和防控提供理论依据。 展开更多
关键词 大肠杆菌 bla_(CTX-M-123)基因 转化试验 适应性代价 致病性
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1株羊源D型产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析 被引量:3
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作者 李娜 刘重阳 +4 位作者 张靖靖 玛丽雅其其格 珠娜 陆斌 海鹰 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第3期1352-1359,共8页
【目的】D型产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌,可引起山羊、绵羊和牛等动物发生肠毒血症,对反刍动物的健康造成巨大的影响。本研究旨在了解内蒙古乌审旗地区D型产气荚膜梭菌耐药情况,为该地区由D型产气荚膜梭菌引起的疾病的治疗提供科... 【目的】D型产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌,可引起山羊、绵羊和牛等动物发生肠毒血症,对反刍动物的健康造成巨大的影响。本研究旨在了解内蒙古乌审旗地区D型产气荚膜梭菌耐药情况,为该地区由D型产气荚膜梭菌引起的疾病的治疗提供科学依据。【方法】通过培养特性及革兰染色镜检对分离菌进行初步鉴定,通过16S rRNA基因序列比对和毒素基因PCR扩增对可疑菌株进一步鉴定,并采用K-B纸片法进行药敏试验,PCR检测分离菌耐药基因。【结果】分离菌在TSC培养基中长出黑色的圆形菌落,革兰染色镜检可见菌体粗短,成单个或双个排列的革兰阳性直杆菌,形态学及镜检结果符合产气荚膜梭菌特点。16S rRNA基因序列比对结果显示,分离菌与NCBI数据库中已公布的产气荚膜梭菌16S rRNA基因序列相似性均>99%,鉴定该菌株为产气荚膜梭菌。毒素基因PCR检测扩增出cpa和etx基因,表明该菌株为D型产气荚膜梭菌。药敏试验结果显示,分离菌对头孢曲松、头孢呋新、庆大霉素等16种抗菌药耐药。耐药基因检测结果显示,分离菌检出bla CTX-M、bla SHV、qnrA和aac(6′)-Ⅰb-cr 4种耐药基因,未检出bla TEM和qnrS 2种耐药基因。【结论】本试验成功从绵羊体内分离出1株D型产气荚膜梭菌,该菌株存在多重耐药,该研究结果为D型产气荚膜梭菌感染绵羊的诊断、流行病学调查和治疗提供了参考依据。 展开更多
关键词 绵羊 D型产气荚膜梭菌 分离鉴定 耐药性
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大肠杆菌FliC蛋白D0/D1结构域与Pal蛋白融合蛋白的生物信息学分析及原核表达
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作者 陈洪 车业贵 +6 位作者 陈长春 丁小丽 邱树磊 陆辉 王永娟 温洪伟 周子祥 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第10期4894-4903,共10页
【目的】构建并表达大肠杆菌FliC蛋白D0/D1结构域与Pal蛋白的融合蛋白,为开发新型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)疫苗提供研究基础。【方法】分析GenBank数据库中大肠杆菌O1血清型菌株的FliC及Pal蛋白氨基... 【目的】构建并表达大肠杆菌FliC蛋白D0/D1结构域与Pal蛋白的融合蛋白,为开发新型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)疫苗提供研究基础。【方法】分析GenBank数据库中大肠杆菌O1血清型菌株的FliC及Pal蛋白氨基酸序列特征,选择FliC蛋白的D0/D1结构域(N-端5-140位氨基酸和C-端499-583位氨基酸)及Pal蛋白主要结构(21-173位氨基酸)构建“三明治型”融合蛋白。对融合蛋白进行理化性质、二级结构、三级结构、抗原性、致敏性及线性和不连续表位预测。通过分子对接和免疫模拟分别评估融合蛋白与免疫受体的结合能力及免疫效果。合成融合蛋白碱基序列并使用pET-28a(+)进行载体构建,采用大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行融合蛋白表达,利用镍-琼脂糖凝胶6FF纯化融合蛋白并进行复性,通过Western blotting验证融合蛋白的反应原性。【结果】融合蛋白分子质量为42.72 ku,是亲水蛋白;α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占48.79%、14.25%、6.76%和30.19%,其中α-螺旋主要处于FliC蛋白D0/D1结构域;三级结构拉氏图显示,优势区域中含有的残基数占96.9%。该融合蛋白具有良好的抗原性,无致敏性,含有8个线性表位和5个不连续表位。该融合蛋白与Toll样受体2、4、5均能进行分子对接,且免疫模拟结果显示,该蛋白能引起良好的体液免疫和细胞免疫。经PCR鉴定和测序确定嵌合基因FliCN-Pal-FliCC阳性单克隆并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功表达纯化出融合蛋白FliCN-Pal-FliCC。融合蛋白能与大肠杆菌O1血清型阳性小鼠的血清发生反应。【结论】本研究成功构建并表达了以APEC O1血清型的FliC和Pal蛋白为基础的“三明治”型融合蛋白FliCN-Pal-FliCC,为研发APEC疫苗候选抗原提供研究基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 FliC蛋白 结构域 Pal蛋白 融合蛋白 生物信息学分析
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江苏省部分地区畜禽源弯曲菌耐药基因、毒力基因及遗传多样性分析
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作者 唐梦君 周倩 +4 位作者 张小燕 唐修君 陆俊贤 陈薇 高玉时 《微生物学通报》 北大核心 2025年第4期1710-1723,共14页
【背景】弯曲菌(Campylobacter)是引起食源性疾病的主要病原菌之一,家禽和猪是其常见和重要宿主,畜禽在屠宰加工过程中易污染胴体导致人类感染,对食品安全和公共健康造成巨大威胁。【目的】通过应用全基因组测序(whole genome sequencin... 【背景】弯曲菌(Campylobacter)是引起食源性疾病的主要病原菌之一,家禽和猪是其常见和重要宿主,畜禽在屠宰加工过程中易污染胴体导致人类感染,对食品安全和公共健康造成巨大威胁。【目的】通过应用全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)分析52株畜禽来源弯曲菌的耐药基因、毒力基因及遗传多样性。【方法】采用琼脂稀释法对其最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)进行测定,通过二代测序平台进行全基因组测序,应用基因组流行病学数据平台ResFinder数据库分析其耐药基因,通过毒力因子数据库(virulence factor database,VFDB)筛选毒力基因,应用PubMLST数据库分析菌株序列型(sequence type,ST)和克隆复合体(clonal complex,CC)。【结果】52株弯曲菌对环丙沙星、四环素、萘啶酸耐药明显,对氟苯尼考敏感,多重耐药率为57.69%。WGS分析发现52株弯曲菌共有6大类16种获得性耐药基因及与喹诺酮类耐药相关的gryA基因点突变和与大环内酯类耐药相关的23S rRNA点突变。除检出常见的氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类(tetO)耐药基因外,还发现ermB、ermA、fexA、optrA、tetL和lnuC等在弯曲菌新流行的耐药基因;52株弯曲菌携带120种毒力相关基因,其中细菌黏附、荚膜合成、侵袭、鞭毛及趋化蛋白等相关基因携带率较高,空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)携带毒力基因的数量普遍多于结肠弯曲菌(Campylobacter coli);多位点序列分析(multilocus sequencing typing,MLST)结果显示共得到28个ST型和14个CCs(包括4个已知的CCs和10个未知CCs,以CC-828克隆复合体为主),分离株之间具有较高的遗传多样性。【结论】江苏畜禽源弯曲菌多重耐药现象严重,耐药基因复杂多样,毒力基因分布广泛,以克隆复合体CC-828为主,具有较高的遗传多样性。该研究结果为我国动物源性弯曲菌耐药性监测提供了基础数据。 展开更多
关键词 弯曲菌 全基因组测序 多重耐药 耐药基因 毒力基因
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猪链球菌2型和9型双重Basic-RPA检测方法的构建与应用
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作者 张慧辉 王可心 +6 位作者 李艳伟 魏小兵 王磊 胡建和 丁轲 刘明成 夏小静 《河南农业大学学报》 北大核心 2025年第5期849-858,共10页
【目的】通过构建猪链球菌(Streptococcus suis,SS)2型(SS2)和9型(SS9)双重快速检测方法,为监测SS的流行和传播提供技术支持。【方法】分别以SS2特有荚膜多糖糖编码基因(capsular polysaccharide 2J gene,cps2J)和SS9特有荚膜多糖糖编... 【目的】通过构建猪链球菌(Streptococcus suis,SS)2型(SS2)和9型(SS9)双重快速检测方法,为监测SS的流行和传播提供技术支持。【方法】分别以SS2特有荚膜多糖糖编码基因(capsular polysaccharide 2J gene,cps2J)和SS9特有荚膜多糖糖编码基因(capsular polysaccharide 9H gene,cps9H)为靶标设计引物和探针,对反应体系和反应条件进行优化,建立基础型重组酶聚合酶等温扩增(Basic-recombinase polymerase amplification,Basic-RPA)快速检测技术,并对其特异性、灵敏度、重复性和临床应用效果进行评价。【结果】构建的SS2/9双重Basic-RPA检测方法引物为CPS2J212和CPS9H304,引物体积V(CPS2J212/μL)∶V(CPS9H304/μL)为2.4∶1.8,反应温度为39℃,反应时间为20 min。特异性结果表明,该方法与其他常见病原体无交叉反应,特异性良好。灵敏度结果显示,该方法针对SS2/9检测限达到1×10^(-3) mg·L^(-1),优于常规PCR的1×10^(-2) mg·L^(-1)。重复性结果显示,该方法有良好的稳定性。用该方法对41例临床样品进行检测,其检出率为24.4%,与单重Basic-RPA方法检测结果一致,高于细菌分离方法的检出率12.2%,以及常规PCR方法的检出率19.5%。【结论】构建的SS2/9的双重Basic-RPA检测方法,特异性和稳定性好,灵敏度高,可应用于SS快速诊断和血清分型。 展开更多
关键词 猪链球菌 基础型重组酶聚合酶等温扩增 荚膜多糖 血清分型 双重检测
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基于统计学方法分析季节对大肠杆菌耐药性的影响
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作者 周倩 唐梦君 +4 位作者 张小燕 陆俊贤 唐修君 陈薇 高玉时 《微生物学通报》 北大核心 2025年第5期2244-2259,共16页
【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)为革兰氏阴性菌,广泛存在于肉鸡的肠道、排泄物、土壤、水和空气中。【目的】研究季节对大肠杆菌的流行情况和耐药性的影响。【方法】对3个定点肉鸡养殖场开展夏季和冬季大肠杆菌流行病学调查,以问... 【背景】大肠杆菌(Escherichia coli)为革兰氏阴性菌,广泛存在于肉鸡的肠道、排泄物、土壤、水和空气中。【目的】研究季节对大肠杆菌的流行情况和耐药性的影响。【方法】对3个定点肉鸡养殖场开展夏季和冬季大肠杆菌流行病学调查,以问卷形式调研3个养殖场基本情况,平板法分离大肠杆菌,对分离株开展14种抗菌药物最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的测定,检测分离株的耐药基因和毒力基因携带情况,最终采用统计学方法实证季节与大肠杆菌分离率的相关性、季节与细菌耐药性的相关性、耐药基因与耐药表型相关性。【结果】3个养殖场大肠杆菌总分离率为94.7%(284/300),A养殖场>C养殖场>B养殖场(100.0%>93.0%>91.0%),同一养殖场夏季和冬季的大肠杆菌分离率的统计学结果无显著差异(P>0.05),A养殖场分离率显著大于B和C养殖场(P<0.05);3个养殖场大肠杆菌分离株表现出多重耐药性,菌株对氨苄西林、头孢噻吩、卡那霉素、四环素、环丙沙星、磺胺甲噁唑、复方新诺明和氟苯尼考高度耐药,并且夏季分离株比冬季分离株耐药率高;进一步采用配对法t检验实证季节与细菌耐药性的相关性,发现仅多黏菌素E耐药性表现季节差异(P<0.05);耐药基因检出率最高的基因为floR,其次为qnrS和mcr-1,blaNDM和aac(6')-Ib检出率较低,cfr基因未检出,3个养殖场基因检出情况与季节相关性不完全一致,耐药表型与基因型相关性分析发现,floR基因与氟苯尼考耐药呈显著正相关(P<0.05),blaNDM基因与氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸耐药呈显著正相关(P<0.05),mcr-1基因与多黏菌素E耐药呈显著正相关(P<0.05),qnrS基因与环丙沙星耐药呈显著正相关(P<0.05);17个毒力基因分析表明fim C、yij P、mat A和iss检出率在70%以上,共有2株大肠杆菌被定义为致病性大肠杆菌。【结论】大肠杆菌在肠道的定殖不受季节影响,肉鸡养殖场大肠杆菌多重耐药性普遍,夏季大肠杆菌分离株比冬季分离株耐药情况严峻,大肠杆菌对多黏菌素E的耐药性与季节有关,细菌耐药性与耐药基因之间存在密切相关性,研究成果提示可在夏季加强细菌耐药性监测,指导肉鸡养殖规范和精准用药,为肉鸡大肠杆菌病防治和合理用药提供参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 细菌耐药性 季节 卡方检验 配对法t检验
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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页
为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多
关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接ELISA
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兔源A型多杀性巴氏杆菌Pm3和Pm6的致病性和基因组特征分析
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作者 王锦祥 苏进博 +5 位作者 付环茹 孙世坤 高承芳 陈冬金 桑雷 谢喜平 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第5期2340-2352,共13页
旨在探究多杀性巴氏杆菌致病性的分子基础。本试验测定了兔源A型多杀性巴氏杆菌Pm3株和Pm6株的致病性,并进一步对其进行全基因组测序和比较基因组学分析。攻毒试验结果显示,Pm3和Pm6滴鼻攻毒后不仅能使试验兔产生严重的化脓性胸膜肺炎,... 旨在探究多杀性巴氏杆菌致病性的分子基础。本试验测定了兔源A型多杀性巴氏杆菌Pm3株和Pm6株的致病性,并进一步对其进行全基因组测序和比较基因组学分析。攻毒试验结果显示,Pm3和Pm6滴鼻攻毒后不仅能使试验兔产生严重的化脓性胸膜肺炎,还能导致试验兔的高死亡率。比较基因组学分析结果显示,Pm3和Pm6的基因组都比兔源低毒力多杀性巴氏杆菌s4株和AH09株的大。与s4和AH09相比,在Pm3和Pm6的基因组中鉴定到约120个具有重要生物学功能的特有基因,且有约100个这些特有基因也存在于兔源强毒力多杀性巴氏杆菌的基因组中。此外,不同动物源多杀性巴氏杆菌基因L3型脂多糖核心寡糖外核合成酶基因natC和gatF的序列存在多态性,但兔源菌株(除SD11、CIRMBP-0873和CIRMBP-0884外)的这两个基因序列却完全一致,表现出一定的宿主特异性。Pm3和Pm6均为强毒力菌株。在Pm3和Pm6基因组中鉴定到的存在于兔源强毒力菌株基因组中但不存在于兔源低毒力菌株基因组中的基因可能在Pm3和Pm6的致病过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 多杀性巴氏杆菌 致病性 全基因组测序 比较基因组学
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鸡毒支原体与鸡滑液囊支原体双重TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用
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作者 董志民 王利丽 +3 位作者 田向学 路超 张莉 鄢明华 《中国兽医学报》 北大核心 2025年第5期987-993,1025,共8页
为快速检测与鉴别鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究根据NCBI数据库中2种病原的16S rRNA基因序列的保守区,分别设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时检测MG... 为快速检测与鉴别鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS),本研究根据NCBI数据库中2种病原的16S rRNA基因序列的保守区,分别设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了一种可同时检测MG和MS的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性和可靠性进行了验证。结果显示,该方法可特异性扩增MG和MS,与21种病原无交叉反应;对MG与MS阳性标准品的检测限分别为5.40×10^(1)、6.60×10^(1)拷贝/μL,敏感性较已知方法提高10~100倍;组内和组间的变异系数均小于1%;与NY/T 553-2015中的单一PCR扩增方法相比,阳性样品、阴性样品及总样品检测符合率均为100.00%;利用该方法检测84份疑似支原体感染的鸡病料样品,结果显示,单一感染MG的病鸡样品阳性率32.14%(27/84)、单一感染MS的样品阳性率22.62%(19/84)、混合感染MG和MS的样品阳性率16.67%(14/84);此外,检测182份健康鸡泄殖腔拭子样品、118份健康鸡鼻拭子样品及74份养鸡场环境样品,结果显示,各类样品中均可检测出支原体阳性样本。结果表明,该方法可适用于多种类型临床样品的检测。综上所述,本研究建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点,可用于MG和MS感染的临床鉴别检测、流行病学调查及病原的净化。 展开更多
关键词 鸡毒支原体 鸡滑液囊支原体 荧光定量PCR 鉴别检测
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1株动物源碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌基因组及耐药质粒水平扩散研究
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作者 王晓旭 张玉杰 +5 位作者 沈莉萍 徐锋 齐新永 刘健 何随彬 赵洪进 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期197-205,共9页
肺炎克雷伯菌(KP)可引起呼吸道、泌尿生殖系感染,创伤、败血症及腹泻,是一种重要的人畜共患病原体。本研究利用细菌基因组三代测序技术和生物信息学平台,对前期工作中分离出的奶牛场养殖环节来源肺炎克雷伯碳青霉烯耐药菌KP329进行了基... 肺炎克雷伯菌(KP)可引起呼吸道、泌尿生殖系感染,创伤、败血症及腹泻,是一种重要的人畜共患病原体。本研究利用细菌基因组三代测序技术和生物信息学平台,对前期工作中分离出的奶牛场养殖环节来源肺炎克雷伯碳青霉烯耐药菌KP329进行了基因组分析及碳青霉烯耐药机制研究。结果显示:KP329染色体总长度为5 337 963 bp,共编码5163个基因,GC含量为57.3%,含有23个耐药基因,MLST分型显示KP329为肺炎克雷伯菌ST101型;KP329携带3个质粒,大小分别为291 962 bp(KP329-1)、105 109 bp(KP329-2)以及4572 bp(KP329-3),其中KP329-1为多重耐药质粒,含有10个耐药基因:aac(3)-IIa、qnrS1、LAP-2、sul1、qacEdelta1、sul2、dfrA1、tet(A)、aph(6)-Id、aph(3'')-Ib,KP329-2只含有1个耐药基因(blaKPC-2),而KP329-3不含有任何已知耐药基因;尽管KP329外膜蛋白OmpK35/OmpK36/ OmpK37发生了氨基酸突变,但对KP329碳青霉烯药物敏感性并无显著影响。细菌结合转移实验则表明,KP329-2质粒可在不同种属细菌发生水平转移,增加宿主菌对碳青霉烯及其他抗生素的抵抗性,具有较高的环境扩散风险。 展开更多
关键词 肺炎克雷伯 碳青霉烯 耐药 基因组分析
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山羊源化脓隐秘杆菌的分离鉴定及生物学特性分析
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作者 刘萍 李兆才 +8 位作者 柳周斌 曹小安 颜新敏 张伟 张向乐 刘永杰 兰喜 何继军 尚佑军 《中国兽医科学》 北大核心 2025年第7期953-958,共6页
为确定导致山羊肝化脓性病变的病原菌,无菌采集化脓性肝炎病灶部位样本,进行细菌分离培养,通过细菌形态学观察和16S rRNA基因测序鉴定细菌种类,并对分离菌株进行毒力基因检测、药敏试验以及对小鼠的致病性试验分析。结果显示:从化脓性... 为确定导致山羊肝化脓性病变的病原菌,无菌采集化脓性肝炎病灶部位样本,进行细菌分离培养,通过细菌形态学观察和16S rRNA基因测序鉴定细菌种类,并对分离菌株进行毒力基因检测、药敏试验以及对小鼠的致病性试验分析。结果显示:从化脓性肝组织中分离鉴定出1株化脓隐秘杆菌,该分离株携带nanH、nanP、fimA、fimC、plo等毒力基因;该分离株对阿米卡星、妥布霉素、氯霉素、氧氟沙星、麦迪霉素、克拉霉素、万古霉素、头孢哌酮和头孢西丁高度敏感,对复方新诺明、多黏菌素B和大部分β-内酰胺类抗生素存在耐药性;该分离株可使试验小鼠肝发生化脓性病变。综上所述,成功地鉴定出化脓隐秘杆菌是导致山羊化脓性肝炎的病原,为研究化脓性杆菌的致病机制提供了参考,也为临床治疗化脓隐秘杆菌感染动物提供了科学依据。 展开更多
关键词 山羊 化脓隐秘杆菌 化脓性 毒力基因
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睡眠嗜组织菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用
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作者 李富祥 高华峰 +1 位作者 赵文华 宋建领 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第7期706-712,共7页
睡眠嗜组织菌(H.somni)是牛、绵羊和山羊的重要致病菌。目前,国内尚无H.somni荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为建立H.somni TaqMan qPCR检测方法,本研究根据H.somni 16S rRNA基因序列设计1对引物和1条TaqMan探针,通过反应体系和反应条件的... 睡眠嗜组织菌(H.somni)是牛、绵羊和山羊的重要致病菌。目前,国内尚无H.somni荧光定量PCR(qPCR)检测方法,为建立H.somni TaqMan qPCR检测方法,本研究根据H.somni 16S rRNA基因序列设计1对引物和1条TaqMan探针,通过反应体系和反应条件的优化,初步建立了H.somni TaqMan qPCR方法。利用建立的方法检测39种牛、绵羊和山羊源的不同细菌,结果显示该方法仅能检测到H.somni,而与溶血性曼氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和海藻百伯史坦菌等38种细菌均无交叉反应,特异性较强。利用建立的方法检测6.3×10^(5)拷贝/μL~6.3×10^(-1)拷贝/μL的重组质粒标准品pMD-16S,结果显示该方法对其的检测限为6.3拷贝/μL,敏感性较高。以6.3×10^(5)拷贝/μL~6.3×10^(3)拷贝/μL的重组质粒标准品pMD-16S为模板,利用建立的方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性较好。利用建立的TaqMan qPCR和文献报道的普通PCR方法同时检测124份患呼吸道疾病牛、山羊和绵羊的肺脏样品和鼻拭子样品,结果显示二者对H.somni的检出率分别为11.29%(14/124)和10.48%(13/124),TaqMan qPCR方法与普通PCR方法的总符合率、阳性符合率和阴性符合率分别为99.19%(123/124)、100%(13/13)和99.10%(110/111),表明该TaqMan qPCR方法的准确性较高。本研究首次在国内建立检测H.somni的qPCR方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性好,为牛、绵羊和山羊H.somni高通量的快速检测提供新的技术支撑。 展开更多
关键词 睡眠嗜组织菌 TaqMan荧光定量PCR 绵羊 山羊
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我国牛源睡眠嗜组织菌的分离鉴定及生物学特性分析
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作者 李富祥 赵文华 +1 位作者 高华峰 宋建领 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期341-347,共7页
为鉴定云南某奶牛场犊牛呼吸道疾病的病原,本研究采用含5%牛血清的哥伦比亚琼脂培养板从2头牛的肺脏样品中分别分离到嗜CO_(2)革兰氏阴性小球杆菌YN24101和YN24102,通过生化试验初步鉴定分离菌;采用PCR扩增分离菌16S rDNA基因并测序,经B... 为鉴定云南某奶牛场犊牛呼吸道疾病的病原,本研究采用含5%牛血清的哥伦比亚琼脂培养板从2头牛的肺脏样品中分别分离到嗜CO_(2)革兰氏阴性小球杆菌YN24101和YN24102,通过生化试验初步鉴定分离菌;采用PCR扩增分离菌16S rDNA基因并测序,经BLAST比对后下载与分离菌同源性较高的巴氏杆菌科参考株的16S rDNA基因序列,采用MegAlign软件分析分离菌16S rDNA基因序列的同源性;利用MEGA 6.0软件中的N-J法构建分离菌16S rDNA基因的遗传进化树,分析分离菌的遗传进化关系。结果显示,2株分离菌大部分生化特征与睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)ATCC 43625T株和其他H.somni参考株相同;2株分离菌与H.somni ATCC 43625T株16S rDNA基因序列的同源性均达99.9%,与其他H.somni参考株16S rDNA基因序列的同源性为99.2%~99.9%;2株分离菌与全部H.somni参考株处于16S rDNA基因进化树的同一进化分支,2株分离菌均鉴定为H.somni。采用K-B纸片扩散法检测分离菌对7类12种抗菌药物的敏感性,结果显示,2株H.somni分离菌均对青霉素类的氨苄西林、头孢菌素类的头孢唑林和头孢曲松以及氨基糖苷类的庆大霉素敏感,但对氨基糖苷类的链霉素、酰胺醇类的氯霉素和氟苯尼考、喹诺酮类的氧氟沙星和诺氟沙星以及磺胺类的磺胺甲恶唑耐药,表明2株分离菌的耐药性均较强,且均呈多重耐药性。将分离菌以不同剂量感染小鼠,通过改良寇氏法计算分离菌对小鼠的半数致死量(LD50),分析分离菌对小鼠的致病性。结果显示,2株H.somni分离菌均能导致小鼠的呼吸道症状,且死亡小鼠仅出现肺脏出血的剖检病变;2株分离菌YN24101和YN24102对小鼠的LD50分别为7.0×10~5cfu和3.3×10~5cfu;表明2株分离菌的致病性均较强。本研究于国内首次报道了牛源H.somni的分离鉴定及其生物学特性,丰富了我国H.somni菌株库,并为牛H.somni的分离培养提供参考方法,为其感染的防控提供参考依据。 展开更多
关键词 睡眠嗜组织菌 分离 鉴定 致病性
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一株羊源马肠链球菌的分离鉴定及生物学特性分析
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作者 王海丽 尹秀升 +5 位作者 贾琪 张峰源 莫玲 李林 董婧 王金良 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第6期641-647,共7页
目的对山东东营某育肥羊场发病绵羊的病原菌进行分离鉴定和提供治疗方案。方法采集病死羊肝脏组织,通过细菌分离、革兰氏染色、药敏试验、小鼠敏感性试验、细菌生化试验以及全基因组测序对分离的菌株进行鉴定和分析。结果分离的菌株(命... 目的对山东东营某育肥羊场发病绵羊的病原菌进行分离鉴定和提供治疗方案。方法采集病死羊肝脏组织,通过细菌分离、革兰氏染色、药敏试验、小鼠敏感性试验、细菌生化试验以及全基因组测序对分离的菌株进行鉴定和分析。结果分离的菌株(命名为SdDy)为革兰氏阳性链球菌,经全基因组测序和生物信息学分析确定为马肠链球菌。该菌株主要参与到代谢过程,对昆明白小鼠具有一定的致病性,对青霉素、氨苄西林、头孢噻呋钠、头孢曲松钠等4种抗生素敏感,对链霉素、阿莫西林、四环素、庆大霉素等4种抗生素耐药,经头孢噻呋钠对发病羊群进行针对性治疗,病情在2 d后得到有效控制。结论本研究成功分离了一株羊源马肠链球菌,并利用全基因组测序技术对其基因组特征进行分析,为羊源马肠链球菌生物学特性、公共卫生及疾病防治与流行病学调查提供参考资料。 展开更多
关键词 绵羊 马肠链球菌 分离鉴定 药敏试验 基因组分析
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猪肉生产环节中沙门菌的污染调查及关键点的消减控制
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作者 孟闯 金宣辰 +4 位作者 彭通通 翟贤月 康喜龙 焦新安 潘志明 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第10期5137-5147,共11页
本研究旨在调查猪养殖场、屠宰场和猪肉销售市场这一猪肉生产链中沙门菌的流行情况并结合分子分型探明沙门菌污染的关键控制点,评估关键控制点相关干预措施对沙门菌的消减防控作用。采集有供应链关系的猪养殖场、屠宰场和猪肉市场相关... 本研究旨在调查猪养殖场、屠宰场和猪肉销售市场这一猪肉生产链中沙门菌的流行情况并结合分子分型探明沙门菌污染的关键控制点,评估关键控制点相关干预措施对沙门菌的消减防控作用。采集有供应链关系的猪养殖场、屠宰场和猪肉市场相关样品进行沙门菌的分离和血清型鉴定,利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对沙门菌分离株进行分子分型和溯源,分析沙门菌污染的关键控制点并评价增加淋洗次数对沙门菌消减的作用。结果表明,采集的950份不同类型样品中分离出沙门菌417株,总分离率为43.9%,其中,养殖场粪便样品80份,分离率为28.8%;屠宰场猪胴体和环境擦拭样品470份,分离率为35.5%,不同屠宰环节中劈半后样品的分离率最高,达51.0%,冷却后的样品分离率显著降低至23.0%(P<0.05);超市猪肉样品400份,分离率为56.8%;沙门菌分离株包含9种血清型,其中,德尔卑沙门菌(39.6%)、鼠伤寒沙门菌(38.1%)、伦敦沙门菌(10.3%)和里森沙门菌(8.4%)为优势血清型。67株德尔卑沙门菌分离株的PFGE分型结果显示,共分为32个脉冲型,其中屠宰场样品的脉冲型分布最广泛,同一批次样品分离株会出现在同一种脉冲型中,存在相似度>95%的屠宰场、养殖场、市场环节分离株,显示其沿生产链传播的特点。在劈半后、修饰前环节增加2次淋洗操作,每次淋洗1 min,使后续环节沙门菌的平均分离率从增加淋洗前的41.7%显著降低至20.0%(P<0.01)。综上,沙门菌可通过交叉污染沿猪肉生产链传播,屠宰过程中的劈半环节是污染的关键控制点之一,增加劈半后的淋洗处理能有效降低猪肉中的沙门菌污染,为猪肉中沙门菌防控提供重要指导。 展开更多
关键词 猪肉 生产链 沙门菌 脉冲场凝胶电泳 关键控制点
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鸭疫里默氏杆菌血清2型的分离鉴定及商品化疫苗免疫保护效果研究
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作者 张蓉蓉 汪最 +8 位作者 郭云清 李国红 程伊洛 卢琴 罗聪 张腾飞 张文婷 胡巧 罗青平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第9期4273-4283,共11页
【目的】本研究拟对从发病雏鸭中分离获得的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)进行生物学特性研究,并通过动物攻毒试验评估当前市售的3种鸭传染性浆膜炎商品化疫苗对新分离菌株的保护效果,以期为鸭传染性浆膜炎的防控提供参... 【目的】本研究拟对从发病雏鸭中分离获得的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)进行生物学特性研究,并通过动物攻毒试验评估当前市售的3种鸭传染性浆膜炎商品化疫苗对新分离菌株的保护效果,以期为鸭传染性浆膜炎的防控提供参考。【方法】采集病死雏鸭肝脏、脑组织分离病原菌,通过形态学观察、16S rRNA基因PCR鉴定和测序、系统进化树构建、血清型分型等方法对分离菌株进行鉴定。通过分光光度法和平板计数法测定分离菌株生长曲线,利用纸片扩散法分析其药物敏感性,通过动物试验测定其半数致死量(LD_(50))和组织载菌量,最后通过攻毒试验评估3种商品化灭活疫苗对分离菌株的免疫保护效果。【结果】试验分离获得1株RA,其为血清2型。药敏试验结果显示,分离株对氨苄西林、头孢他啶和卡那霉素等10种药物均表现耐药,对阿莫西林、头孢噻肟、氟苯尼考和链霉素表现敏感。生长曲线测定结果显示,培养6~10 h,分离株进入对数生长期,培养8 h后活菌数可达到10^(9) CFU/mL;对雏鸭的LD_(50)为7.65×10^(4.7)CFU,雏鸭感染后心脏组织载菌量最高。3种商品化灭活疫苗免疫7日龄雏鸭后2周用分离菌株进行攻毒,结果显示,1+2+7型多价RA灭活疫苗保护效果最好,保护率可达70%,而另外2种疫苗保护率<50%。【结论】本研究分离获得1株多重耐药、高致病性血清2型RA,当前市售RA商品化疫苗对其免疫保护效果有限。研究结果为当前鸭传染性浆膜炎的防控提供理论依据。 展开更多
关键词 鸭疫里默氏杆菌 血清2型 生物学特性 商品化疫苗
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