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麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质
被引量：
2
1
作者
王晶晶
张新笑
+4 位作者
卞欢
耿志明
李鹏鹏
王道营
徐为民
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第5期1120-1126,共7页
[目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨...
[目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→ Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。[结果]克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 kD,理论等电点(pI)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DG-Px4。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32 ℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu^2+和Ni^2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg^2+和Mn^2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca^2+和Zn^2+对DG-Px4活力则无明显的促进或抑制作用。[结论]从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。
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关键词
麻鸭
磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPx4)
原核表达
纯化
酶学性质
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职称材料
题名
麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质
被引量：
2
1
作者
王晶晶
张新笑
卞欢
耿志明
李鹏鹏
王道营
徐为民
机构
江苏省农业科学院农产品加工研究所
南京农业大学肉品加工与质量控制教育部重点实验室
江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心
出处
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第5期1120-1126,共7页
基金
国家自然科学基金青年科学基金项目(31701532)
江苏省自然科学基金项目(BK20171324)
江苏省农业科学院农产品加工研究所基金项目(JG201702)
文摘
[目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→ Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。[结果]克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 kD,理论等电点(pI)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DG-Px4。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32 ℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu^2+和Ni^2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg^2+和Mn^2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca^2+和Zn^2+对DG-Px4活力则无明显的促进或抑制作用。[结论]从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。
关键词
麻鸭
磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPx4)
原核表达
纯化
酶学性质
Keywords
shelduck
phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase(GPx4)
prokaryotic expression
purifi-cation
enzymatic properties
分类号
S843.83 [农业科学—畜牧兽医]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质
王晶晶
张新笑
卞欢
耿志明
李鹏鹏
王道营
徐为民
《南方农业学报》
CAS
CSCD
北大核心
2019
2
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