【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【...【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【方法】以番鸭卵巢组织cDNA为模板,通过PCR扩增MAPK1基因并测序,运用生物信息学工具分析MAPK1蛋白理化性质及主要抗原表位,筛选免疫原区段。对免疫原序列进行大肠杆菌密码子优化并人工合成,经同源重组克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达载体pET30a-MAPK1并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在HB-PET自诱导培养基中表达、纯化MAPK1重组蛋白,将纯化蛋白与QuickAntibody-Rabbit8W佐剂混合后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blotting、细胞免疫荧光(CIF)、组织免疫荧光(TIF)和免疫组化(IHC)等方法检测多克隆抗体的效价、特异性与适用性,并以颗粒细胞标志物促卵泡激素受体(FSHR)为参照分析MAPK1表达定位。【结果】成功克隆了番鸭MAPK1基因,大小约1107 bp,编码368个氨基酸。MAPK1蛋白理论分子质量约42 ku。生物信息学预测显示,MAPK1蛋白不含信号肽和跨膜结构;第50—100、200—300和250—350位氨基酸区段亲水性良好,第30—90和200—300氨基酸区段抗原指数较高,第30—70、120—150、200—260及320—360位氨基酸区段的氨基酸表面暴露概率较大。MAPK1蛋白二级结构以α-螺旋为主,包含典型激酶保守结构,活化环呈无规则卷曲状态,主要定位于细胞质和细胞核。综合蛋白特性,最终筛选了第4—364位氨基酸作为候选免疫原区段。成功构建原核重组表达载体pET30-MAPK1,MAPK1重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量约48 ku。成功制备了兔抗鸭MAPK1蛋白多克隆抗体,ELISA结果显示该抗体效价达1∶102400;Western blotting、CIF、TIF和IHC结果显示,制备的多克隆抗体可特异识别MAPK1重组蛋白及番鸭卵泡颗粒细胞和卵泡中的内源性MAPK1蛋白。在颗粒细胞中,MAPK1主要定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核;在卵泡中,MAPK1主要分布于卵泡颗粒细胞层,表达定位与FSHR基本一致。【结论】试验成功制备了番鸭MAPK1多克隆抗体,该抗体特异性良好,适用于番鸭卵泡相关细胞与组织样本中MAPK1的免疫学检测。研究结果为MAPK1在卵泡发育及生殖调控中的功能研究提供了技术支撑。展开更多
睾丸和附睾作为精子发生、成熟及储存的核心器官,其基因表达模式与精液品质的分子调控机制密切相关。本研究以230日龄健康公鸭为对象,通过精液品质分析筛选出高、低品质组个体,利用RNA-Seq技术对睾丸和附睾组织进行转录组测序,结合生物...睾丸和附睾作为精子发生、成熟及储存的核心器官,其基因表达模式与精液品质的分子调控机制密切相关。本研究以230日龄健康公鸭为对象,通过精液品质分析筛选出高、低品质组个体,利用RNA-Seq技术对睾丸和附睾组织进行转录组测序,结合生物信息学分析和qPCR验证,系统揭示与精液品质相关的基因表达特征及调控网络。高、低精液品质组睾丸和附睾组织分别鉴定出344个和878个显著差异表达基因(Differentially expression genes,DEGs),对筛选到的DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能注释和富集分析发现:睾丸组织中,CHRNA10、PCK1、ADGRD1和KLHL4等基因显著差异表达,DEGs主要参与代谢相关通路(如氯离子通道复合物)及细胞进程;附睾组织中,TTR、FAM237B、SLC5A7和SAA2等基因显著差异表达,发现雄性配子发生、精细胞分化及免疫相关通路(如细胞因子-细胞因子受体相互作用)显著富集。相关性分析表明,IL12RB1、KCNIP4等基因与精子活力、运动参数及睾丸体积呈正相关(P<0.05),而GJB7、SMPDL3B等基因与精子死亡率呈显著负相关。进一步验证显示,RNA-Seq结果与qPCR表达趋势一致。本研究发现睾丸和附睾组织中DEGs通过调控能量代谢、免疫平衡及精子发生等过程影响精液品质,研究结果为解析鸭精液品质的分子机制提供了新依据,并为遗传改良和繁殖性能提升提供了潜在分子标记。展开更多
【背景】家禽卵泡发育具有独特的等级卵泡发育特性,受自分泌、旁分泌、生长因子和多种功能基因的共同调控。颗粒细胞是卵泡内数量最多的功能细胞,颗粒细胞的存活直接决定了卵泡的生长发育和成熟。铁死亡是一种新发现细胞程序性死亡方式...【背景】家禽卵泡发育具有独特的等级卵泡发育特性,受自分泌、旁分泌、生长因子和多种功能基因的共同调控。颗粒细胞是卵泡内数量最多的功能细胞,颗粒细胞的存活直接决定了卵泡的生长发育和成熟。铁死亡是一种新发现细胞程序性死亡方式,与卵泡发育密切相关。泛素特异性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18,USP18)在铁死亡过程中发挥重要的调控作用,但其在蛋鸭卵巢颗粒细胞中的功能尚不清楚。【目的】通过探究USP18在蛋鸭卵泡颗粒细胞铁死亡过程中的分子调控机制,为家禽产蛋性状的遗传改良提供理论基础和分子靶点。【方法】选取300日龄高、低产蛋鸭各4只,采集等级前卵泡组织,实时荧光定量PCR和Western blotting检测高、低产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达水平;分离等级前颗粒细胞,设计USP18干扰片段并转染卵巢颗粒细胞,采用CCK-8试剂盒、Calcein-AM/PI细胞双染法检测USP18对颗粒细胞活力的影响,活性氧检测试剂盒和酶联免疫吸附法分析USP18对颗粒细胞内氧化应激水平的影响;利用线粒体膜电位试剂盒、脂质过氧化荧光探针、铁离子FerroOrange探针、普鲁士蓝试剂盒检测USP18对颗粒细胞铁死亡的影响;通过免疫荧光、免疫共沉淀和Western blotting分析USP18与谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白间的互作关系及GPX4蛋白表达水平。【结果】高产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达量显著高于低产蛋鸭(P<0.01);敲降USP18显著降低颗粒细胞活力(P<0.01),抑制颗粒细胞存活(P<0.05),促进ROS积累(P<0.01),提高丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.01),抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性(P<0.01);敲降USP18显著提高颗粒细胞内脂质过氧化水平(P<0.05),降低线粒体膜电位(P<0.05),增强线粒体膜通透性(P<0.01),提高细胞内铁离子水平和铁沉积(P<0.01),促进铁死亡抑制因子A长链酰基辅酶A合成酶4(acyl-coA synthetase long chain family member 4,ACSL4)和GPX4表达并抑制铁死亡驱动因子转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1,TFR1)表达(P<0.01);免疫共沉淀和免疫荧光证实USP18可与GPX4互作;Western blotting和免疫共沉淀结果显示敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。【结论】USP18在高产蛋鸭等级前卵泡组织中高表达;敲降USP18显著提高了蛋鸭卵巢颗粒细胞内氧化应激水平并诱发铁死亡;USP18可与GPX4蛋白发生互作,敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。综上所述,USP18通过抑制GPX4泛素化降解调控蛋鸭卵巢颗粒细胞铁死亡。展开更多
文摘睾丸和附睾作为精子发生、成熟及储存的核心器官,其基因表达模式与精液品质的分子调控机制密切相关。本研究以230日龄健康公鸭为对象,通过精液品质分析筛选出高、低品质组个体,利用RNA-Seq技术对睾丸和附睾组织进行转录组测序,结合生物信息学分析和qPCR验证,系统揭示与精液品质相关的基因表达特征及调控网络。高、低精液品质组睾丸和附睾组织分别鉴定出344个和878个显著差异表达基因(Differentially expression genes,DEGs),对筛选到的DEGs进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能注释和富集分析发现:睾丸组织中,CHRNA10、PCK1、ADGRD1和KLHL4等基因显著差异表达,DEGs主要参与代谢相关通路(如氯离子通道复合物)及细胞进程;附睾组织中,TTR、FAM237B、SLC5A7和SAA2等基因显著差异表达,发现雄性配子发生、精细胞分化及免疫相关通路(如细胞因子-细胞因子受体相互作用)显著富集。相关性分析表明,IL12RB1、KCNIP4等基因与精子活力、运动参数及睾丸体积呈正相关(P<0.05),而GJB7、SMPDL3B等基因与精子死亡率呈显著负相关。进一步验证显示,RNA-Seq结果与qPCR表达趋势一致。本研究发现睾丸和附睾组织中DEGs通过调控能量代谢、免疫平衡及精子发生等过程影响精液品质,研究结果为解析鸭精液品质的分子机制提供了新依据,并为遗传改良和繁殖性能提升提供了潜在分子标记。
文摘【背景】家禽卵泡发育具有独特的等级卵泡发育特性,受自分泌、旁分泌、生长因子和多种功能基因的共同调控。颗粒细胞是卵泡内数量最多的功能细胞,颗粒细胞的存活直接决定了卵泡的生长发育和成熟。铁死亡是一种新发现细胞程序性死亡方式,与卵泡发育密切相关。泛素特异性肽酶18(ubiquitin specific peptidase 18,USP18)在铁死亡过程中发挥重要的调控作用,但其在蛋鸭卵巢颗粒细胞中的功能尚不清楚。【目的】通过探究USP18在蛋鸭卵泡颗粒细胞铁死亡过程中的分子调控机制,为家禽产蛋性状的遗传改良提供理论基础和分子靶点。【方法】选取300日龄高、低产蛋鸭各4只,采集等级前卵泡组织,实时荧光定量PCR和Western blotting检测高、低产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达水平;分离等级前颗粒细胞,设计USP18干扰片段并转染卵巢颗粒细胞,采用CCK-8试剂盒、Calcein-AM/PI细胞双染法检测USP18对颗粒细胞活力的影响,活性氧检测试剂盒和酶联免疫吸附法分析USP18对颗粒细胞内氧化应激水平的影响;利用线粒体膜电位试剂盒、脂质过氧化荧光探针、铁离子FerroOrange探针、普鲁士蓝试剂盒检测USP18对颗粒细胞铁死亡的影响;通过免疫荧光、免疫共沉淀和Western blotting分析USP18与谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)蛋白间的互作关系及GPX4蛋白表达水平。【结果】高产蛋鸭等级前卵泡组织中USP18表达量显著高于低产蛋鸭(P<0.01);敲降USP18显著降低颗粒细胞活力(P<0.01),抑制颗粒细胞存活(P<0.05),促进ROS积累(P<0.01),提高丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量(P<0.01),抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性(P<0.01);敲降USP18显著提高颗粒细胞内脂质过氧化水平(P<0.05),降低线粒体膜电位(P<0.05),增强线粒体膜通透性(P<0.01),提高细胞内铁离子水平和铁沉积(P<0.01),促进铁死亡抑制因子A长链酰基辅酶A合成酶4(acyl-coA synthetase long chain family member 4,ACSL4)和GPX4表达并抑制铁死亡驱动因子转铁蛋白受体1(transferrin receptor protein 1,TFR1)表达(P<0.01);免疫共沉淀和免疫荧光证实USP18可与GPX4互作;Western blotting和免疫共沉淀结果显示敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。【结论】USP18在高产蛋鸭等级前卵泡组织中高表达;敲降USP18显著提高了蛋鸭卵巢颗粒细胞内氧化应激水平并诱发铁死亡;USP18可与GPX4蛋白发生互作,敲降USP18提高GPX4泛素化水平并促进GPX4蛋白降解。综上所述,USP18通过抑制GPX4泛素化降解调控蛋鸭卵巢颗粒细胞铁死亡。
