【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【...【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【方法】以番鸭卵巢组织cDNA为模板,通过PCR扩增MAPK1基因并测序,运用生物信息学工具分析MAPK1蛋白理化性质及主要抗原表位,筛选免疫原区段。对免疫原序列进行大肠杆菌密码子优化并人工合成,经同源重组克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达载体pET30a-MAPK1并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在HB-PET自诱导培养基中表达、纯化MAPK1重组蛋白,将纯化蛋白与QuickAntibody-Rabbit8W佐剂混合后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blotting、细胞免疫荧光(CIF)、组织免疫荧光(TIF)和免疫组化(IHC)等方法检测多克隆抗体的效价、特异性与适用性,并以颗粒细胞标志物促卵泡激素受体(FSHR)为参照分析MAPK1表达定位。【结果】成功克隆了番鸭MAPK1基因,大小约1107 bp,编码368个氨基酸。MAPK1蛋白理论分子质量约42 ku。生物信息学预测显示,MAPK1蛋白不含信号肽和跨膜结构;第50—100、200—300和250—350位氨基酸区段亲水性良好,第30—90和200—300氨基酸区段抗原指数较高,第30—70、120—150、200—260及320—360位氨基酸区段的氨基酸表面暴露概率较大。MAPK1蛋白二级结构以α-螺旋为主,包含典型激酶保守结构,活化环呈无规则卷曲状态,主要定位于细胞质和细胞核。综合蛋白特性,最终筛选了第4—364位氨基酸作为候选免疫原区段。成功构建原核重组表达载体pET30-MAPK1,MAPK1重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量约48 ku。成功制备了兔抗鸭MAPK1蛋白多克隆抗体,ELISA结果显示该抗体效价达1∶102400;Western blotting、CIF、TIF和IHC结果显示,制备的多克隆抗体可特异识别MAPK1重组蛋白及番鸭卵泡颗粒细胞和卵泡中的内源性MAPK1蛋白。在颗粒细胞中,MAPK1主要定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核;在卵泡中,MAPK1主要分布于卵泡颗粒细胞层,表达定位与FSHR基本一致。【结论】试验成功制备了番鸭MAPK1多克隆抗体,该抗体特异性良好,适用于番鸭卵泡相关细胞与组织样本中MAPK1的免疫学检测。研究结果为MAPK1在卵泡发育及生殖调控中的功能研究提供了技术支撑。展开更多
【目的】基于全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)技术筛选和鉴定金定鸭产蛋数性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点及候选基因,为金定鸭产蛋性状的分子育种提供参考信息。【方法】采...【目的】基于全基因组关联研究(genome-wide association study,GWAS)技术筛选和鉴定金定鸭产蛋数性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点及候选基因,为金定鸭产蛋性状的分子育种提供参考信息。【方法】采用441只同批次健康金定鸭(母鸭)群体作为研究对象,分别收集每只个体从产第一枚蛋开始至43周龄、55周龄和72周龄的产蛋数(分别为W43、W55和W72)共3个产蛋数性状。所有441只个体翅静脉采血后进行全基因组重测序,下机数据与鸭参考基因组(ZJU1.0)比对得到全基因组范围内的SNPs位点,利用plink软件质控后获取高质量SNPs位点,使用ASReml-R 4.2软件多性状动物模型估计43周龄、55周龄、72周龄产蛋数性状的遗传力,以及两两性状间的遗传相关、表型相关。利用gemma软件分别对3个产蛋数性状进行全基因组关联分析,鉴定3个产蛋数性状共享的关联标记位点,利用bedtools软件对这些位点进行注释,挖掘标记位点附近的候选基因。【结果】金定鸭W43、W55和W72遗传力均较低,遗传力范围在0.17-0.30之间,并随着周龄的增加,遗传力逐渐降低。不同周龄产蛋数间均具有较高的遗传正相关,相邻时间点间的遗传相关系数高于间隔时间点之间的遗传相关系数,其中W43与W55的遗传相关系数为0.75,W55与W72遗传相关系数为0.89。GWAS研究结果表明,W43筛选到174个潜在显著SNPs位点(P<9.43×10^(-7)),分布于3、13、21号染色体上;W55筛选到297个潜在显著SNPs位点(P<9.43×10^(-7)),分布于3、13号染色体上;W72筛选到36个潜在显著SNPs位点(P<9.43×10^(-7)),均位于3号染色体上。3个产蛋数性状共享20个重叠的潜在显著SNPs位点(P<9.43×10^(-7)),且均位于3号染色体上。这些位点形成了两个较大的单倍型块,并涉及5个候选基因,包括参与钙离子作用的VSNL1基因、参与中胚层形成的MSGN1基因、具有钾离子通道作用的KCNS3基因,参与DNA修复的SMC6和GEN1基因。【结论】估计了金定鸭43周龄、55周龄和72周龄产蛋数性状的遗传参数,通过产蛋数性状的GWAS研究鉴定了同时影响3个周龄产蛋数性状的20个潜在显著的SNPs位点、5个候选基因,这些结果为金定鸭产蛋数性状分子育种提供了参考信息。展开更多
