文摘目的:阐明细丝蛋白B基因(filamin B,FLNB)第1542位异亮氨酸(Ile/I)→苏氨酸(Thr/T)突变(FLNB p.Ile1542Thr,FLNB^(I1542T))在休门氏后凸畸形(Scheuermann′s kyphosis,SK)中的机制。方法:对一个汉族SK家系进行标准化临床评估,包括脊柱X线、CT三维重建及MRI检查。通过全外显子测序与Sanger测序筛选并验证致病性变异,依据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南进行致病性评估。采用CRISPR-Cas9技术构建携带FLNB^(I1542T)突变的小鼠模型,通过外观观察、显微CT成像及组织学染色(HE、Masson、Safranin O/Fast Green)对模型表型进行评估,以确认其是否重现SK特异的软骨终板缺陷与局部后凸畸形。利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)结合生物信息学分析,解析软骨终板病理发育过程中关键的致病软骨细胞亚群及其靶分子调控网络。通过单细胞流式分选致病性软骨细胞亚群,并进一步利用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)验证FLNB^(I1542T)对c-Jun蛋白表达水平的影响;利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)、双荧光素酶报告基因等实验分析c-Jun对细胞外基质(extracellular matrix,ECM)稳态关键分子Serpinh1的转录激活调控,并利用免疫组化、Western blot分析Jun对ECM稳态的调控作用。结果:通过对先证者全外显子测序,鉴定出一个杂合FLNB c.4625T>C(p.Ile1542Thr)突变,与患者表型共分离,且计算预测提示其破坏蛋白稳定性。利用CRISPR-Cas9技术构建的FLNB^(I1542T)基因敲入小鼠,在生长发育过程中表现出与人SK患者相似的进行性胸腰段后凸、椎体体积与长度减小、骨化延迟及终板凹陷等影像学与组织病理学特征。单细胞转录组测序分析揭示,突变主要靶向并损害了终板软骨中的软骨形成细胞亚群的功能,导致该群细胞中与“软骨发育”和“细胞外基质组织”相关的基因表达程序显著下调。分子机制研究表明,FLNB^(I1542T)突变削弱了转录因子c-Jun的蛋白水平及其转录活性。c-Jun可直接结合并激活分子伴侣Serpinh1的启动子,而FLNB^(I1542T)突变导致的Jun功能抑制致使SERPINH1表达显著下降。SERPINH1的下游关键客户蛋白,包括COL2A1、COL9A3和COL11A2等维持ECM稳态的胶原蛋白,其表达也随之降低,从而破坏了软骨终板的ECM完整性。功能挽救实验证实,过表达Jun可逆转由FLNB^(I1542T)突变引起的SERPINH1及其下游胶原蛋白的表达下调。结论:FLNB^(I1542T)通过损害Jun的转录活性,抑制SERPINH1表达,从而破坏ECM胶原稳态,驱动SK的软骨终板缺陷与后凸畸形。
文摘目的:通过单细胞RNA测序阐明免疫细胞与纤维环细胞相互作用的时空动态特征。方法:实验采用12只8周龄雄性Sprague Dawley大鼠,并随机分为3组:正常对照组(NT)、针刺退变7d组(IDD7)及针刺退变14d组(IDD14),每组三只大鼠的椎间盘组织合并作为一个scRNA-seq样本(即NT/IDD7/IDD14各1个样本,n=3大鼠/组)。椎间盘组织经过混合的多种胶原酶消化后,并未进行流式分选,直接利用BD Rhapsody平台,对3个样本开展了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。通过以下流程解析细胞动态变化:采用Seurat对原始计数矩阵进行质量控制、标准化及批次校正(Harmony算法整合),保留基因表达均值用于后续分析。通过FindVariableFeatures筛选2000个高变基因,经主成分分析(principal component analysis,PCA)降维后,采用Louvain聚类算法(分辨率0.2)对细胞进行分群,并结合SingleR工具进行细胞类型注释,获取各亚群的标志基因。对比正常对照组(NT)、针刺退变7d组(IDD7)及针刺退变14d组(IDD14)间的差异表达基因(筛选阈值:|logFC|>0.5,P<0.05)。使用基于R语言开发的生物信息学软件包ClusterProfiler与enrichR软件分别对差异基因进行GO(gene ontology)生物学过程与KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析(P<0.05,基因数≥2),筛选显著相关通路。基于Monocle3构建伪时间轨迹,将整合数据转换为cell_data_set对象,经UMAP(uniform manifold approximation and projection)降维与Louvain聚类后,利用learn_graph与order_cells函数揭示细胞状态演化路径。运用CellChat与CellPhoneDB分析配体-受体相互作用,计算细胞间通讯概率,可视化关键信号通路(如细胞因子、生长因子)在NT与IDD组间的动态变化。采用免疫荧光技术对CD68(巨噬细胞标记物)、SPP1、CD44等蛋白的共定位表达进行定量分析。结果:单细胞数据鉴定出9个主要细胞群:纤维环细胞(NP)、纤维环细胞(AF)、巨噬细胞(Mφ)、单核细胞、中性粒细胞、T细胞、成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞。74个基因持续差异表达,主要与免疫细胞趋化相关。并系统解析了纤维环细胞的时序性分子变化。纤维环细胞存在修复型(Fibro-1/3)与耗竭型(Fibro-2)两极分化,为精准干预提供靶群依据。拟时序T1期可能(对应IDD7d)是应激保护向纤维化转化的关键节点,为阻断不可逆损伤提供治疗窗口期。细胞互作动态演变:纤维环亚群中耗竭型Fibro-2与巨噬细胞的互作数最多,SPP1信号轴由Fibro-2主导发送,Mφ-3为主要接收者,该通路可能驱动纤维环细胞向促纤维化表型转化,提示其可能参与基质破坏和纤维化重塑进程。结论:纤维环细胞可能通过SPP1-CD44信号轴增强与巨噬细胞的相互作用,进而激活炎症反应并加速基质降解。这一发现揭示了椎间盘退变过程中的关键细胞受体-配体对,为IDD的精准干预提供了新的潜在治疗靶点。
