目的研究蛋白激酶A(PKA)在人诱导多能干细胞(iPSCs)向巨核细胞(MKs)分化过程中的调控作用。方法构建PKA过表达质粒,利用慢病毒转染系统将其导入人脐血来源的iPSCs中建立PKA过表达细胞系;采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PKA基因敲除iPS...目的研究蛋白激酶A(PKA)在人诱导多能干细胞(iPSCs)向巨核细胞(MKs)分化过程中的调控作用。方法构建PKA过表达质粒,利用慢病毒转染系统将其导入人脐血来源的iPSCs中建立PKA过表达细胞系;采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PKA基因敲除iPS细胞系。通过蛋白水平检测验证两种细胞系中PKA的表达情况。在无血清、无饲养层的“旋转-拟胚体(Spin-EB)”培养体系中,将细胞分为对照组(untreated组)、PKA过表达组(OV组)和PKA敲除组(KO组),在培养至第21天时,收集各组细胞,采用流式细胞术检测巨核系标志物(CD41^(+))和成熟巨核标志物(CD41^(+)CD42a^(+))的表达水平。结果构建PKA过表达和PKA敲除的人iPS细胞系:PKA OV iPSCs和PKA KO iPSCs,并经western-blot验证。在“Spin-EB”分化体系中培养至第21天,PKA OV iPSCs分化生成的CD41^(+)细胞比例及细胞数量无显著差异(P>0.05),CD41^(+)CD42a^(+)细胞比例和数量明显减少(P<0.01;P<0.05)。在PKA KO iPSCs中,分化生成的CD41^(+)细胞比例及数量、CD41^(+)CD42a^(+)细胞比例及数量均显著增加(P<0.001;P<0.001;P<0.01;P<0.01)。结论本研究成功构建了PKA基因修饰iPSCs,并验证PKA在iPSCs分化为MKs中的调控作用,为优化人诱导多能干细胞源血小板生成体系提供了新靶点。PKA过表达抑制了iPSCs向成熟MKs分化,而PKA敲除则显著促进了iPSCs向MKs的分化。展开更多
文摘目的研究蛋白激酶A(PKA)在人诱导多能干细胞(iPSCs)向巨核细胞(MKs)分化过程中的调控作用。方法构建PKA过表达质粒,利用慢病毒转染系统将其导入人脐血来源的iPSCs中建立PKA过表达细胞系;采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PKA基因敲除iPS细胞系。通过蛋白水平检测验证两种细胞系中PKA的表达情况。在无血清、无饲养层的“旋转-拟胚体(Spin-EB)”培养体系中,将细胞分为对照组(untreated组)、PKA过表达组(OV组)和PKA敲除组(KO组),在培养至第21天时,收集各组细胞,采用流式细胞术检测巨核系标志物(CD41^(+))和成熟巨核标志物(CD41^(+)CD42a^(+))的表达水平。结果构建PKA过表达和PKA敲除的人iPS细胞系:PKA OV iPSCs和PKA KO iPSCs,并经western-blot验证。在“Spin-EB”分化体系中培养至第21天,PKA OV iPSCs分化生成的CD41^(+)细胞比例及细胞数量无显著差异(P>0.05),CD41^(+)CD42a^(+)细胞比例和数量明显减少(P<0.01;P<0.05)。在PKA KO iPSCs中,分化生成的CD41^(+)细胞比例及数量、CD41^(+)CD42a^(+)细胞比例及数量均显著增加(P<0.001;P<0.001;P<0.01;P<0.01)。结论本研究成功构建了PKA基因修饰iPSCs,并验证PKA在iPSCs分化为MKs中的调控作用,为优化人诱导多能干细胞源血小板生成体系提供了新靶点。PKA过表达抑制了iPSCs向成熟MKs分化,而PKA敲除则显著促进了iPSCs向MKs的分化。
