目的克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RTPCR)克隆Der f 7基因。将测序正确的目的片段克隆至pET...目的克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RTPCR)克隆Der f 7基因。将测序正确的目的片段克隆至pET-32a表达载体,得到的重组质粒pET-32a-Der f 7在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,蛋白质印迹(Western Blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果RT-PCR结果显示,Der f 7基因片段大小约为650 bp。测序结果表明,Der f 7基因片段与已发表的粉尘螨Der f 7基因(登录号为FJ436108)同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组质粒pET32a-Der f 7在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白相对分子质量(M r)约为23 000。Western Blotting分析结果表明,Der f 7重组蛋白可被尘螨过敏患者血清识别。结论成功构建了粉尘螨第7类变应原的原核表达载体,并获得具有免疫原性的Der f 7重组蛋白。展开更多
目的探讨粉尘螨变应原Derf1mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组(10只/组),分别为PBS组、Derf1变应原致敏组、Derf1变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Derf1 mRNA免疫治疗组。分别于第0...目的探讨粉尘螨变应原Derf1mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组(10只/组),分别为PBS组、Derf1变应原致敏组、Derf1变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Derf1 mRNA免疫治疗组。分别于第0、第7和第14天,PBS组小鼠腹腔注射PBS,其余4组小鼠则腹腔注射10μg Der f 1进行致敏,建立小鼠哮喘模型。自第21天起,除PBS组小鼠雾化吸入PBS,其他4组小鼠均雾化吸入100μg/ml Der f 1变应原,30 min/次,1次/d,连续7 d,观察并记录小鼠哮喘发作情况。5组小鼠于最后1次雾化吸入致敏2周后,背部皮下分别注射100μl PBS、1μg Der f1(维持致敏)、10μg Derf1(免疫治疗)、2μgβ-actin mRNA和2μg Derf1mRNA,1次/周,连续3周。最后1次皮下注射后2周处死小鼠。收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)和白介素13(IL-13)水平,并计数嗜酸粒细胞(EOS);收集各组小鼠脾组织,分离脾细胞,除PBS组外,其他4组均加入10μg/ml Der f 1培养72 h,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-13水平;取各组小鼠眼球血,ELISA法检测血清中总IgE以及变应原特异性IgE(sIgE)、IgG1(sIgG1)和IgG2a(sIgG2a)抗体水平。HE染色观察各组小鼠肺组织切片。结果除PBS组外,其他4组小鼠雾化吸入致敏后,均出现急性哮喘发作症状。小鼠BALF中,Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(897.56±105.73)和(864.48±70.62)pg/ml,均明显高于Derf1变应原致敏组[(209.05±52.28)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(219.47±64.72)pg/ml](P<0.01);两者IL-13水平分别为(241.64±31.41)和(321.94±41.07)pg/ml,则明显低于Derf1变应原致敏组[(520.62±43.77)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(507.22±42.26)pg/ml](P<0.01);两者EOS数量分别为(1.33±0.44)×105和(1.48±0.39)×105个/ml,均明显低于Derf1变应原致敏组[(3.54±0.52)×105个/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(2.98±0.53)×105个/ml](P<0.01)。脾细胞培养上清的ELISA检测结果显示,Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(420.91±69.92)和(334.92±43.72)pg/ml,明显高于Der f 1变应原致敏组[(123.75±15.48)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(128.84±59.00)pg/ml](P<0.01);两者IL-13水平[(268.51±40.42)和[(285.26±62.21)pg/ml]则显著低于Der f 1变应原致敏组[(613.89±51.54)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(524.05±39.12)pg/ml](P<0.01)。血清中抗体水平的ELISA检测结果显示,Der f 1 mRNA免疫治疗组的总IgE、sIgE和sIgG1抗体水平分别为(33.72±9.78)、(22.76±8.09)和(17.87±7.59)ng/ml,均显著低于Der f 1变应原致敏组[(94.34±11.66)、(65.67±9.47)和(75.18±9.52)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(86.48±10.26)、(62.36±8.35)和(69.51±8.98)ng/ml](P<0.01);其sIgG2a抗体水平为(7.74±0.88)ng/ml,则明显高于Der f 1变应原致敏组[(2.81±1.17)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(1.06±0.11)ng/ml](P<0.01)。肺组织切片HE染色镜检结果显示,与Der f 1变应原致敏组相比,Der f 1 mRNA免疫治疗组小鼠的气道上皮和肺泡上皮细胞结构基本完整,炎症细胞浸润明显减少。结论 Derf1mRNA疫苗可有效纠正Th1/Th2失衡。展开更多
目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快...目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。展开更多
文摘目的克隆和表达粉尘螨第7类变应原基因,并鉴定重组蛋白的免疫原性。方法提取粉尘螨总RNA,根据GenBank提供的Der f 7编码区(CDS)(登录号为AY 283292)序列设计特异性引物,逆转录PCR(RTPCR)克隆Der f 7基因。将测序正确的目的片段克隆至pET-32a表达载体,得到的重组质粒pET-32a-Der f 7在大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白表达和纯化结果,蛋白质印迹(Western Blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果RT-PCR结果显示,Der f 7基因片段大小约为650 bp。测序结果表明,Der f 7基因片段与已发表的粉尘螨Der f 7基因(登录号为FJ436108)同源性为99%。SDS-PAGE结果显示,重组质粒pET32a-Der f 7在BL21(DE3)中高效表达,重组蛋白相对分子质量(M r)约为23 000。Western Blotting分析结果表明,Der f 7重组蛋白可被尘螨过敏患者血清识别。结论成功构建了粉尘螨第7类变应原的原核表达载体,并获得具有免疫原性的Der f 7重组蛋白。
文摘目的探讨粉尘螨变应原Derf1mRNA疫苗对哮喘小鼠的特异性免疫治疗效果。方法 50只BALB/c小鼠随机分为5组(10只/组),分别为PBS组、Derf1变应原致敏组、Derf1变应原免疫治疗组、β-actin mRNA免疫治疗组和Derf1 mRNA免疫治疗组。分别于第0、第7和第14天,PBS组小鼠腹腔注射PBS,其余4组小鼠则腹腔注射10μg Der f 1进行致敏,建立小鼠哮喘模型。自第21天起,除PBS组小鼠雾化吸入PBS,其他4组小鼠均雾化吸入100μg/ml Der f 1变应原,30 min/次,1次/d,连续7 d,观察并记录小鼠哮喘发作情况。5组小鼠于最后1次雾化吸入致敏2周后,背部皮下分别注射100μl PBS、1μg Der f1(维持致敏)、10μg Derf1(免疫治疗)、2μgβ-actin mRNA和2μg Derf1mRNA,1次/周,连续3周。最后1次皮下注射后2周处死小鼠。收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测γ干扰素(IFN-γ)和白介素13(IL-13)水平,并计数嗜酸粒细胞(EOS);收集各组小鼠脾组织,分离脾细胞,除PBS组外,其他4组均加入10μg/ml Der f 1培养72 h,ELISA法检测脾细胞培养上清液中IFN-γ和IL-13水平;取各组小鼠眼球血,ELISA法检测血清中总IgE以及变应原特异性IgE(sIgE)、IgG1(sIgG1)和IgG2a(sIgG2a)抗体水平。HE染色观察各组小鼠肺组织切片。结果除PBS组外,其他4组小鼠雾化吸入致敏后,均出现急性哮喘发作症状。小鼠BALF中,Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(897.56±105.73)和(864.48±70.62)pg/ml,均明显高于Derf1变应原致敏组[(209.05±52.28)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(219.47±64.72)pg/ml](P<0.01);两者IL-13水平分别为(241.64±31.41)和(321.94±41.07)pg/ml,则明显低于Derf1变应原致敏组[(520.62±43.77)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(507.22±42.26)pg/ml](P<0.01);两者EOS数量分别为(1.33±0.44)×105和(1.48±0.39)×105个/ml,均明显低于Derf1变应原致敏组[(3.54±0.52)×105个/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(2.98±0.53)×105个/ml](P<0.01)。脾细胞培养上清的ELISA检测结果显示,Der f 1 mRNA免疫治疗组和Der f 1免疫治疗组的IFN-γ水平分别为(420.91±69.92)和(334.92±43.72)pg/ml,明显高于Der f 1变应原致敏组[(123.75±15.48)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(128.84±59.00)pg/ml](P<0.01);两者IL-13水平[(268.51±40.42)和[(285.26±62.21)pg/ml]则显著低于Der f 1变应原致敏组[(613.89±51.54)pg/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(524.05±39.12)pg/ml](P<0.01)。血清中抗体水平的ELISA检测结果显示,Der f 1 mRNA免疫治疗组的总IgE、sIgE和sIgG1抗体水平分别为(33.72±9.78)、(22.76±8.09)和(17.87±7.59)ng/ml,均显著低于Der f 1变应原致敏组[(94.34±11.66)、(65.67±9.47)和(75.18±9.52)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(86.48±10.26)、(62.36±8.35)和(69.51±8.98)ng/ml](P<0.01);其sIgG2a抗体水平为(7.74±0.88)ng/ml,则明显高于Der f 1变应原致敏组[(2.81±1.17)ng/ml]和β-actin mRNA免疫治疗组[(1.06±0.11)ng/ml](P<0.01)。肺组织切片HE染色镜检结果显示,与Der f 1变应原致敏组相比,Der f 1 mRNA免疫治疗组小鼠的气道上皮和肺泡上皮细胞结构基本完整,炎症细胞浸润明显减少。结论 Derf1mRNA疫苗可有效纠正Th1/Th2失衡。
文摘目的获得粉尘螨(Dermatophagoides farinae)变应原Der f 8全长基因并构建其原核表达质粒。方法参考Gen Bank登录号为AY283295的Der f 8部分序列设计并合成引物。以粉尘螨总RNA为模板,RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段。采用5′cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得Der f 8全长序列,连接至pMD19-T载体,热转化至大肠埃希菌(Escherichia coli),挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。根据Der f 8全长序列设计并合成引物,以粉尘螨总RNA为模板进行RT-PCR扩增,产物回收后连接pCold TF载体,热转化至E.coli,涂板过夜培养后,挑取阳性菌落,抽提质粒后测序。将pCold TF-Der f 8质粒转化至E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达产物。采用生物信息学软件预测Der f 8的理化特性、结构和功能,并构建系统进化树。结果以Der f 8部分序列设计的引物行RT-PCR扩增获得Der f 8部分片段,长度为600 bp;5′RACE获得Der f 8剩余序列,长度为300 bp;以全长基因序列设计的引物进行RT-PCR扩增获得了Der f 8基因CDS区,长度为696 bp,测序均正确。SDSPAGE结果显示,目的蛋白为可溶性表达,相对分子质量(M_r)为81 000,与预期大小一致。序列经生物信息学分析结果显示,Der f 8全长序列与参考序列(Gen Bank登录号为AY283295)同源性为98.49%,预测其编码的疏水性蛋白具有谷胱甘肽S转移酶活性,二级结构包括α-螺旋(45.45%)、延伸主链(11.26%)和无规卷曲(43.29%)。系统进化树结果显示,粉尘螨与户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)聚成一簇。结论获得了Der f 8全长基因及其原核表达质粒。
