目的结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA),建立一种快速、便捷的检测棘球绦虫及进一步鉴定细粒棘球绦虫的方法。方法以棘球绦虫细胞色素C氧化酶亚基1(co1)和NADH脱氢酶亚基5(nd5)的基因为靶序列,利用Primer Premier 6软件设计特异性引物和探...目的结合重组酶聚合酶扩增技术(RPA),建立一种快速、便捷的检测棘球绦虫及进一步鉴定细粒棘球绦虫的方法。方法以棘球绦虫细胞色素C氧化酶亚基1(co1)和NADH脱氢酶亚基5(nd5)的基因为靶序列,利用Primer Premier 6软件设计特异性引物和探针并进行筛选,建立棘球绦虫核酸双探针荧光RPA检测方法。采用不同DNA拷贝数(10^(4)、10^(3)、10^(2)、10、1个拷贝/µl)的含co1和nd5的重组质粒,评价该方法的敏感度。以多房棘球绦虫、猪带绦虫、日本血吸虫、美洲钩虫、巴西日本圆线虫、华支睾吸虫、蓝氏贾第鞭毛虫、微小隐孢子虫、刚地弓形虫和田鼠巴贝虫基因组DNA评价该方法的特异性。利用23份模拟样品(棘球绦虫原头节DNA和阴性犬粪提取的DNA混合)和5份现场采集的犬粪细粒棘球绦虫阳性DNA样品(经PCR鉴定)评价该方法的可行性。结果针对棘球绦虫基因组DNA建立的FAM/HEX双探针荧光RPA检测法的最佳反应条件为39℃、金属浴300 rpm振荡反应4 min后,采用荧光定量PCR(qPCR)检测荧光信号12.5 min,总反应时长16.5 min。敏感度检测结果显示,该法对co1和nd5重组质粒的最低检出限分别为10拷贝/µl和100拷贝/µl。特异性检测结果显示,该法仅对细粒棘球绦虫有FAM/HEX双重荧光信号,对多房棘球绦虫有FAM单荧光信号,而对猪带绦虫、日本血吸虫、美洲钩虫和华支睾吸虫等9种寄生虫基因组DNA无特异性反应。可行性评价结果显示,含有细粒棘球绦虫基因组DNA的16份模拟样品产生FAM/HEX双阳性信号,其中8份为混合细粒棘球绦虫基因组DNA的模拟样品,8份为混合细粒和多房棘球绦虫基因组DNA的模拟样品,仅含有多房棘球绦虫基因组DNA的7份模拟样品产生FAM单阳性信号,5份现场采集的犬粪细粒棘球绦虫阳性DNA样品产生FAM/HEX双阳性信号,其他DNA样品均无任何阳性信号。该法的检测结果与PCR法的检测结果一致。结论本研究建立了基于双探针荧光RPA检测棘球绦虫的方法,且该方法可鉴定出细粒棘球绦虫,其检出限低、特异性强,操作简单快捷。展开更多
