目的观察刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型棒状体蛋白16(rhoptry protein 16,ROP16)对肺腺癌细胞中程序性死亡配体-1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)表达的影响,探索刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白对肺腺癌细胞PD-L1相对表达量、细胞膜表面...目的观察刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型棒状体蛋白16(rhoptry protein 16,ROP16)对肺腺癌细胞中程序性死亡配体-1(programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)表达的影响,探索刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白对肺腺癌细胞PD-L1相对表达量、细胞膜表面相对分布量及程序性死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD1)/PD-L1结合的影响。方法分别构建过表达刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白慢病毒载体,并转染A549细胞系。以A549细胞为空白对照组,A549细胞转染慢病毒空表达载体为阴性对照组,过表达刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白的A549细胞为实验组。通过嘌呤霉素筛选稳定过表达细胞株并通过Western blotting、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)及免疫荧光实验进行验证。利用Western blotting及RT-qPCR技术分别检测刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白过表达组及空白对照组、阴性对照组A549细胞中PD-L1表达水平,并通过流式细胞术对细胞膜表面PD-L1相对分布量进行检测。以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)为原理设计PD-1/PD-L1表面结合实验,评估A549细胞内刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白对PD-1/PD-L1结合的影响。结果空白对照组、阴性对照组及刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16过表达组中ROP16蛋白相对表达量分别为0、0、1.546±0.091、1.822±0.047、2.334±0.089,ROP16 mRNA相对表达量分别为2.153±0.949、2.436±1.614、14.343±0.020、12.577±0.285、15.090±0.420,差异均有统计学意义(F=1339.00、483.50,P均<0.001);与空白对照组比较,刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16过表达组中ROP16蛋白及mRNA表达水平均升高(P均<0.001)。免疫荧光实验结果显示,刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16蛋白主要定位于细胞核中。空白对照组、阴性对照组及刚地弓形虫Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ROP16过表达组PD-L1蛋白相对表达量分别为0.685±0.109、0589±0.114、1.007±0.117、0.572±0.151、0.426±0.116,PD-L1 mRNA相对表达量分别为1.012±0.190、1.281±0.465、1.950±0.175、0.889±0.251、0.230±0.192,差异均有统计学意义(F=9.46、14.18,P均<0.05);与空白对照组比较,刚地弓形虫Ⅰ型ROP16过表达组PD-L1蛋白及mRNA表达水平均升高(P均<0.05)。流式细胞术检测结果表明,空白对照组、阴性对照组和刚地弓形虫Ⅰ型ROP16过表达组PD-L1蛋白在A549细胞膜表面相对分布量分别为(10.83±0.60)%、(11.23±0.20)%、(14.61±0.50)%,差异有统计学意义(F=28.31,P<0.05);与空白对照组及阴性对照组比较,刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白过表组中PD-L1蛋白在细胞膜表面的相对分布量上调(P均<0.001)。ELISA检测结果表明,在重组PD-1蛋白浓度为0.04、0.08、0.12μg/mL时,刚地弓形虫Ⅰ型ROP16过表达组、空白对照组、阴性对照组细胞吸光度(absorbance,A)值差异均有统计学差异(F=10.45、11.68、52.68,P均<0.05),其中刚地弓形虫Ⅰ型ROP16过表达组A值均高于空白对照组及阴性对照组(P均<0.05),表明刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白以浓度依赖方式促进A549细胞中PD-L1/PD-1结合。结论过表达刚地弓形虫Ⅰ型ROP16蛋白可在m RNA及蛋白水平上调A549细胞中PD-L1表达及其在A549细胞膜表面的相对分布量,并以浓度依赖方式影响PD-1/PD-L1结合。展开更多
