目的:建立Taq M an-MGB探针Real-tim e荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法:在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性Taq M an-MGB探针法引物及探针,通过Real-tim ePCR反应条件和反应体系的优化,实现对单增李...目的:建立Taq M an-MGB探针Real-tim e荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法:在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性Taq M an-MGB探针法引物及探针,通过Real-tim ePCR反应条件和反应体系的优化,实现对单增李斯特菌的快速检测;用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果:方法的灵敏性高,其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系,最低可检测57个拷贝数,经18 h增菌,可检测低至4.5 cfu/m l的细菌;特异性强,检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值(CT值)均小于25,而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值(CT值)大于35;快速,最快1 h可出结果,实际样品20 h可出结果,而常规细菌培养法需要一周以上;对103份速冻米面食品进行检测,13份阳性,与常规方法无显著性差异(P>0.05)。结论:Taq M an-MGB探针的单增李斯特菌Real-tim e荧光PCR检测方法具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,可推广应用。展开更多
文摘目的:建立Taq M an-MGB探针Real-tim e荧光PCR快速检测单增李斯特菌技术。方法:在对单增李斯特菌invA序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性Taq M an-MGB探针法引物及探针,通过Real-tim ePCR反应条件和反应体系的优化,实现对单增李斯特菌的快速检测;用克隆到pMD18-T载体上的李斯特菌invA基因阳参片段及不同菌株、食品标本验证方法的特异性和敏感性。结果:方法的灵敏性高,其循环阈值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系,最低可检测57个拷贝数,经18 h增菌,可检测低至4.5 cfu/m l的细菌;特异性强,检测6株单增李斯特菌标准株和100株单增李斯特菌样品分离株的PCR循环域值(CT值)均小于25,而90株威氏李斯特菌、英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌以及非李斯特菌PCR循环域值(CT值)大于35;快速,最快1 h可出结果,实际样品20 h可出结果,而常规细菌培养法需要一周以上;对103份速冻米面食品进行检测,13份阳性,与常规方法无显著性差异(P>0.05)。结论:Taq M an-MGB探针的单增李斯特菌Real-tim e荧光PCR检测方法具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,可推广应用。
