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IAV绝对定量PCR构建及其在体外感染巨噬细胞中的实验研究
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作者 阙婷 蓝利 +6 位作者 张潇剑 袁江浪 孔星星 樊晓晖 张增峰 唐深 罗小玲 《广西医科大学学报》 CAS 2022年第4期637-642,共6页
目的:构建实时荧光定量PCR(RT-qPCR)绝对定量法检测甲型流感病毒(IAV),研究其在检测IAV体外感染巨噬细胞(Mφ)中病毒复制动态变化的应用效能。方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞刺激活化为Mφ,分为Mφ组和Mφ感染组[IAV的感染复数(MOI)为0.... 目的:构建实时荧光定量PCR(RT-qPCR)绝对定量法检测甲型流感病毒(IAV),研究其在检测IAV体外感染巨噬细胞(Mφ)中病毒复制动态变化的应用效能。方法:佛波酯(PMA)诱导THP-1细胞刺激活化为Mφ,分为Mφ组和Mφ感染组[IAV的感染复数(MOI)为0.1、0.5、1、1.5、2、5、10、15、20,共9个感染剂量组]。构建RT-qPCR绝对定量检测法检测IAV体外感染Mφ模型中细胞内和培养上清病毒核酸拷贝数;CCK-8法检测24 h内不同MOI的流感病毒对Mφ细胞活性的影响,选取10^(5)~10^(6) TCID50的最佳MOI作为感染模型剂量;采用红细胞凝集实验(HA)检测感染模型细胞内和培养上清的病毒生物合成水平。结果:构建RT-qPCR的标准曲线为Y=-3.345X+38.454,具有良好的线性关系,检测下限为10^(2) copies/μL,10倍稀释梯度在10^(3)~10^(8)区分度和重复性良好;与Mφ组相比,随着MOI增加,Mφ活性下降(P<0.05),感染后贴壁Mφ形态出现变圆悬浮、胞质内大量颗粒、胞体模糊和细胞破裂等变化,且MOI越大,病变程度越严重;以105~106TCID50为依据,选取MOI=0.5、1、2、5、10作为Mφ体外感染的剂量;体外感染的细胞内和培养上清病毒核酸浓度随MOI增大而升高;Mφ感染组细胞内病毒标本HA效价均为1∶64,培养上清的HA效价在1∶32~1∶64。结论:构建RT-qPCR绝对定量法成功检测到体外感染Mφ细胞内和培养上清病毒核酸拷贝数呈逐渐增加趋势,并与细胞病变程度呈正相关关系;HA结果无法准确区分病毒复制趋势,RT-qPCR绝对定量法的敏感度和区分度均较HA高。 展开更多
关键词 荧光定量PCR IAV 巨噬细胞 体外模型
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