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红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立 被引量：18
1
作者 冯娟 高苒 +8 位作者 全雄志 邸冉 董伟 马春梅 黄澜 刘亚莉 曹兴水 秦川 张连峰 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2007年第4期267-270,I0003,I0004,共6页
目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chicken-βactin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定红色荧光和绿... 目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chicken-βactin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型,活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的组织形态。结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。经荧光显微镜观察,DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达,尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达,成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。 展开更多
关键词 红色荧光蛋白 绿色荧光蛋白 转基因 模型 动物
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小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 被引量：7
2
作者 包杰 王前 +5 位作者 郑磊 曾方银 刘杰 熊石龙 裘宇容 李娟 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期585-587,共3页
目的构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础。方法利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成d... 目的构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础。方法利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stb13感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度。结果测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存。系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml。结论成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。 展开更多
关键词 基因 RelB RNA干扰 慢病毒载体 滴度
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大鼠坐骨神经损伤后降钙素基因相关肽在脊髓神经元及运动终板中的变化 被引量：8
3
作者 王树森 胡蕴玉 +4 位作者 白建萍 马雁 王军 吕荣 姚庆君 《中国临床康复》 CAS CSCD 2004年第20期4008-4009,i004,共3页
目的:观察周围神经损伤后降钙素基因相关肽(Calcitoningen-relatedpeptide,CGRP)在脊髓神经元及运动终板中的变化,以探讨CGRP与运动终板退行性变的关系。方法:以切断坐骨神经的大鼠为模型,以免疫组化方法结合计算机图像分析技术检测CGR... 目的:观察周围神经损伤后降钙素基因相关肽(Calcitoningen-relatedpeptide,CGRP)在脊髓神经元及运动终板中的变化,以探讨CGRP与运动终板退行性变的关系。方法:以切断坐骨神经的大鼠为模型,以免疫组化方法结合计算机图像分析技术检测CGRP在脊髓神经元及运动终板中的变化,并以镀银法作同期运动终板退行性变的观察。结果:神经损伤1周后CGRP即在脊髓前角运动神经元中升至最高,并持续4周,8周后恢复正常。在正常胫前肌中可见神经末梢及运动终板均被CGRP抗体清晰标记。神经损伤1周后,CGRP在神经末梢和运动终板中即完全消失。神经切断后镀银法显示运动终板在前2周无明显变化,3周运动终板开始部分染色模糊、浅淡,8周运动终板完全消失。结论:在运动终板退行性变的机制中,CGRP的缺乏可能是一个重要的因素。 展开更多
关键词 坐骨神经 降钙素基因相关肽 运动神经肌肉终板 大鼠
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人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建 被引量：7
4
作者 梁旭竞 陈小佳 +4 位作者 金玲 李丽玲 汤绍辉 陈友鹏 杨冬华 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第15期2931-2936,共6页
背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化。目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体。设... 背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化。目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体。设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成。材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6/V5-DEST,ccdBSurvival,Stbl3及293FT细胞由暨南大学生物工程研究所提供。方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点HindⅢ,BgⅢ),通过酶切及连接反应形成pDONR221-hTERT-EGFP。采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP。将pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞。主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功。包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况。结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-hTERT-EGFP成功构建。转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光。结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法。 展开更多
关键词 端粒酶反转录酶 绿色荧光蛋白 慢病毒载体
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抗PIWIL2蛋白多克隆抗体的制备、鉴定及初步应用 被引量：5
5
作者 朱风尚 黄志刚 +4 位作者 胡莺 张小燕 陈锡美 孟逊 郜恒骏 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1034-1037,共4页
目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testislike 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布。方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin... 目的:制备兔抗人PIWIL2(P-element-induced wimpy testislike 2,或称HIWI2)的多克隆抗体,并鉴定其特异性,初步探讨其在人正常及肿瘤组织中的分布。方法:人工合成特异性PIWIL2多肽,以马来酰胺活化匙孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)为载体构建多肽免疫原,致敏大白兔,制备兔抗人PIWIL2多克隆抗体。亲和层析法纯化抗体,ELISA和Western印迹鉴定特异性,人组织芯片行PIWIL2的免疫组化研究。结果:通过构建PIWIL2多肽-KLH载体复合物致敏大白兔,制备出兔抗人PIWIL2蛋白多克隆抗体。ELISA及Western印迹证实兔抗人PIWIL2抗体可特异性识别PIWIL2多肽。人组织芯片免疫组化染色显示,PIWIL2在肿瘤细胞的表达具有组织特异性,大多数正常和癌组织的平滑肌细胞胞质中呈阳性染色。结论:成功制备出兔抗人PIWIL2多克隆抗体,为后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 PIWIL2蛋白 多克隆抗体 组织芯片
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“承载丸”对股骨头坏死大鼠细胞黏附分子基因的影响 被引量：7
6
作者 黄克勤 陈燕平 +5 位作者 薛延 郎凤萍 黄宏 黄辉 黄永勋 张景辰 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第28期5495-5498,共4页
背景:研究表明承载丸治疗激素性股骨头坏死具有明确的疗效,可明显增加骨密度、骨重量、骨强度和刚性,能改变雌激素水平低下状态。目的:观察承载丸对激素性股骨头坏死大鼠骨细胞中细胞黏附分子基因的影响,以明确该药对坏死股骨头内血管... 背景:研究表明承载丸治疗激素性股骨头坏死具有明确的疗效,可明显增加骨密度、骨重量、骨强度和刚性,能改变雌激素水平低下状态。目的:观察承载丸对激素性股骨头坏死大鼠骨细胞中细胞黏附分子基因的影响,以明确该药对坏死股骨头内血管恢复正常血运的作用。设计、时间及地点:分组对照观察,于2006-03/08在中国中医科学院望京医院药理实验室及生物芯片北京国家工程研究中心所属博奥芯片公司实验室完成。材料:6月龄雄性SD大鼠6只,体质量(280±20)g。承载丸主要成分:有当归,杜仲,黄芪,枸杞子,鹿角霜,肉苁蓉、地鳖虫,水蛭、丹参,续断等22味中药。由北京市勃然制药有限公司提供。方法:6只SD大鼠采用内毒素和甲基强地松龙制做激素性股骨头坏死动物模型,随机将大鼠分为模型组和承载组,每组各3只。承载组大鼠自第1次注射甲基强地松龙后,灌服承载丸药液1.5g/kg,1次/d,共灌服6周。6周后取股骨头提取总RNA,进行基因谱测试。主要观察指标:基因谱测试结果中的细胞黏附分子基因作用路径分析。结果:3只模型大鼠使用承载丸后,与模型大鼠相比较,出现1.5倍以上改变的基因,分别为633个(下调506个,上调127个)、883个(下调640个,上调243个)、593个(下调408个,上调185个)。使用MAS软件归类分析后,共有相关作用路径79个,涉及297个基因。其中细胞黏附分子路径有8个下调基因。结论:大鼠服用承载丸后,使上述基因下调,恢复了大鼠巨噬细胞及靶细胞的识别功能,恢复了上皮细胞包括血管内皮细胞的正常生存条件,细胞黏附分子作用路径持正常水平,这是坏死股骨头内血管恢复正常血运的关键。 展开更多
关键词 中药 股骨头坏死 细胞黏附分子基因
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甲羟戊酸激酶基因真核及shRNA表达载体构建及其对BxPC-3细胞周期蛋白表达的影响 被引量：5
7
作者 金锐 王芳 +2 位作者 栾康 罗欣 张胜权 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2016年第1期22-26,共5页
目的 构建甲羟戊酸激酶（MVK）基因真核及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞中,观察其对细胞周期蛋白的影响。方法 从BxPC-3细胞中提取总RNA,逆转录PCR（RT-PCR）法获得目的基因MVK以及通过化学合成MVK（751~779）和MVK（1089~1117）位... 目的 构建甲羟戊酸激酶（MVK）基因真核及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞中,观察其对细胞周期蛋白的影响。方法 从BxPC-3细胞中提取总RNA,逆转录PCR（RT-PCR）法获得目的基因MVK以及通过化学合成MVK（751~779）和MVK（1089~1117）位点寡核苷酸片段,构建真核表达及shRNA表达载体并转染至BxPC-3细胞,筛选稳定表达细胞系。Westernblot法分析转染后对BxPC-3细胞周期蛋白的影响。结果 成功获得MVK基因真核表达（pcD-NA3.1-mvk）及两个针对MVK shRNA表达载体（piLenti-RNAi-shRNA1/2）。通过抗生素筛选及Westernblot分析获得了稳定的MVK过表达及低表达细胞株。Westernblot分析显示：过表达MVK的细胞株及MVK knockdown的细胞株中细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinE表达量与正常及对照细胞相比均显著降低。结论 MVK过表达及低表达均抑制Bx-PC-3细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表达。 展开更多
关键词 甲羟戊酸激酶 基因重组 寡核苷酸 细胞周期蛋白 BXPC-3 SHRNA
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炎症胶质细胞中诱导型一氧化氮合酶基因转录的机制 被引量：6
8
作者 沈勤 施建华 +2 位作者 顾建兰 殷冬梅 张然 《中国临床康复》 CSCD 北大核心 2006年第30期101-104,共4页
目的:通过瞬时转染p38MAPK途径中上游激酶,组成激活型MAPK激酶3和MAPK激酶6,进一步了解p38MAPK级联传导信号系统调节诱导型一氧化氮合酶基因在胶质细胞中的转录激活机制。方法:实验于2003-01/2004-08在美国南卡洲医科大学神经科学研究... 目的:通过瞬时转染p38MAPK途径中上游激酶,组成激活型MAPK激酶3和MAPK激酶6,进一步了解p38MAPK级联传导信号系统调节诱导型一氧化氮合酶基因在胶质细胞中的转录激活机制。方法:实验于2003-01/2004-08在美国南卡洲医科大学神经科学研究室和南通大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室进行。采用MAPK激酶3和MAPK激酶6表达质粒与接有荧光素酶的大鼠诱导型一氧化氮合酶启动基因质粒;cAMP反应元件和核因子-κB联合转染C6胶质细胞株。测定荧光素酶活性,观察诱导型一氧化氮合酶基因激活表达机制。结果:①MKK3b/MKK6b能引起诱导型一氧化氮合酶启动基因质粒的激活,并都能够被p38MAPK抑制剂SB203580所抑制。②MKK可以诱导cAMP反应元件介导的和核因子-κB依赖的转录活性。③显性抑制型CRE结合蛋白和CCAAT/增强子结合蛋白都是p38MAPK的靶向作用目标,转染这两种转录因子产生相反的影响:显性抑制型CRE结合蛋白增强了诱导型一氧化氮合酶启动基因质粒的表达,而显性抑制型CCAAT/增强子结合蛋白则引起抑制作用,对cAMP反应元件也具有相同的影响。④此外,激活型MAPK激酶3和MAPK激酶6诱导诱导型一氧化氮合酶启动子的激活能够被野生型活化转录因子增强。然而磷酸化缺陷型的野生型活化转录因子则起抑制作用。结论:转录因子的靶向作用特点,对于炎症反应中NO的过量产生具有选择干扰性,在临床上具有实用价值。 展开更多
关键词 细胞外信号调节MAP激酶类 NF-κB 一氧化氮合酶 神经胶质/细胞学 转染
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小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建 被引量：3
9
作者 智深深 朱静 +4 位作者 田杰 刘官信 鲁荣 林建萍 刘建平 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期170-173,共4页
目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆... 目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。 展开更多
关键词 慢病毒感染 RNA干扰 基因 Islet-1 细胞分化
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人重组表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合应用对糖尿病创面愈合过程的修复效应 被引量：22
10
作者 宋振强 王润秀 《中国临床康复》 CSCD 北大核心 2006年第5期53-55,共3页
目的:联合应用重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,探讨其对糖尿病创面愈合过程的影响。方法:选择2001-05/2005-03广西医科大学烧伤整形康复中心收治的29例糖尿病足部溃疡患者,均自愿签署知情同意书。采用随机表法将29例患者... 目的:联合应用重组人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,探讨其对糖尿病创面愈合过程的影响。方法:选择2001-05/2005-03广西医科大学烧伤整形康复中心收治的29例糖尿病足部溃疡患者,均自愿签署知情同意书。采用随机表法将29例患者随机分为4组:联合用药组7例、重组人表皮生长因子组8例、碱性成纤维细胞生长因子组6例、生理盐水对照组8例。各组患者均在处理创面前将空腹血糖控制在11.1mmol/L以下,伴感染者经有效抗生素静脉滴注至感染完全控制,创面刮除病理性肉芽。联合用药组给予外用重组人表皮生长因子1500IU/次,外喷碱性成纤维细胞生长因子720AU/次;重组人表皮生长因子组单纯给予外用重组人表皮生长因子1500IU/次;碱性成纤维细胞生长因子组给予外喷碱性成纤维细胞生长因子720AU/次;生理盐水对照组仅用生理盐水擦拭创面。各组敷料包扎,隔天换药,于处理创面后第3,7,14天观察创面上皮葡行情况和肉芽组织成熟程度。结果:实验选用糖尿病足患者29例,全部进入结果分析。①创面处理后不同时间各组创面愈合率的比较:创面处理后第3天各组基本相似(P>0.05);创面处理后第7天,与生理盐水对照组比较,联合用药组和重组人表皮生长因子组均明显提高(P<0.05);创面处理后14天,与生理盐水对照组比较,联合用药组、重组人表皮生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组均显著提高(21.67±1.53)%,(33.50±1.56)%,(28.77±1.50)%,(23.73±1.20)%(P<0.01或0.05),以联合用药组升高最为明显。②创面处理后不同时间各组肉芽组织生长大体观察情况:各组于创面处理后第3,7天创面肉芽组织生长情况均基本相似(P>0.05)。创面处理后第14天,联合用药组创面肉芽组织生长情况明显优于重组人表皮生长因子组、碱性成纤维细胞生长因子组、生理盐水对照组(P<0.05)。结论:重组生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合应用对于糖尿病创面的治疗具有协同效应。 展开更多
关键词 糖尿病足 表皮生长因子-尿抑胃素 成纤维细胞生长因子 碱性 药物疗法 联合 皮肤/损伤 伤口
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肌腱愈合及粘连形成机制的研究:胰岛素样生长因子1基因真核表达载体的构建及表达 被引量：4
11
作者 程昌志 张正治 +5 位作者 潘险峰 苟俊 孙玮 潘峰 傅晓岚 白贵友 《中国临床康复》 CSCD 2004年第20期3984-3986,i002,共4页
目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检... 目的:探讨真核表达载体介导外源性胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染肌腱细胞的可能性。方法:组织块法培养原代肌腱细胞,体外重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1,并以脂多胺DOGS为介导转染培养的肌腱细胞,反转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测IGF-1mRNA的表达,ELISA法检测IGF-1活性蛋白表达。结果:成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1;RT-PCR检测显示转染后的肌腱细胞成功表达IGF-1mRNA;ELISA结果显示转染组IGF-1蛋白表达较对照组明显增高(t=-2.873,P<0.05)。结论:重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IGF-1能够将IGF-1cDNA成功导入肌腱细胞并表达。 展开更多
关键词 胰岛素样生长因子Ⅰ 腱/细胞学 基因表达 遗传载体 转染
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中国汉族、维吾尔族、哈萨克族、蒙古族健康绝经后妇女维生素D受体基因多态性的分布(英文) 被引量：3
12
作者 张红红 韩志涛 +7 位作者 陶国枢 高宇红 刘建伟 吴青 牟小芬 胡亚卓 陈瑞英 冷兴文 《中国临床康复》 CSCD 北大核心 2006年第20期160-162,共3页
背景:维生素D受体基因在内切酶BsmⅠ,ApaⅠ,TaqⅠ作用下,呈限制性内切酶片段长度多态性,并且与骨密度密切相关熏而骨密度的变化对骨质疏松起着重要作用,但维生素D受体基因多态性与骨密度、骨质疏松相关性尚无定论。目的:分析在中国汉族... 背景:维生素D受体基因在内切酶BsmⅠ,ApaⅠ,TaqⅠ作用下,呈限制性内切酶片段长度多态性,并且与骨密度密切相关熏而骨密度的变化对骨质疏松起着重要作用,但维生素D受体基因多态性与骨密度、骨质疏松相关性尚无定论。目的:分析在中国汉族、维吾尔族、哈萨克族、蒙古族绝经后妇女中与骨密度密切相关的维生素D受体基因多态性分布规律。设计:对比观察。单位:解放军总医院老年医学研究所。对象:选择2002-01/2003-12在解放军总医院进行健康体检的汉族绝经后妇女179名,平均年龄穴59±3雪岁。选择2001-01/2003-12于解放军兰州军区乌鲁木齐总医院老年科进行健康体检的维吾尔族、哈萨克族、蒙古族绝经后妇女者122,63,112名,平均年龄分别为(56±4),(55±3),(57±3)岁。均对检测项目知情同意。方法:应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性技术确定维生素D受体基因BsmⅠ基因型,分析汉族、维吾尔族、哈萨克族和蒙古族绝经后妇女维生素D受体基因BsmⅠ多态性分布频率,并与已知的美国、澳大利亚、法国和日本相应数据进行比较。计数资料差异比较采用χ2检验。主要观察指标:汉族、维吾尔族、哈萨克族和蒙古族绝经后妇女维生素D受体基因BsmⅠ多态性分布频率,以及该分布特点与美国、澳大利亚、法国和日本相应数据比较结果。结果:汉族、维吾尔族、哈萨克族和蒙古族绝经后妇女维生素D受体基因bb基因型频率分别为90.5%,69.67%,38.1%和50%,BB基因型频率分别为0,4.1%,6.35%和4.46%,汉族与维吾尔族、哈萨克族和蒙古族维生素D受体基因型频率分布比较,差异明显穴P<0.01雪。哈萨克族与欧美人种比较熏维生素D受体基因型差异不明显,与日本、韩国人种差异明显(P<0.01)。结论:中国汉族与维吾尔族、哈萨克族和蒙古族绝经后妇女维生素D受体基因型多态性具明显种族差异性;哈萨克族维生素D受体基因型频率分布接近欧美人种,与日本、韩国人种差异明显。 展开更多
关键词 多态现象(遗传学) 汉族 基因型 受体 骨化三醇/遗传学 维吾尔族 遗传学 群体 中国
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小鼠水通道蛋白1基因慢病毒载体构建及其在神经膜细胞中的表达 被引量：2
13
作者 章杰 江华 +3 位作者 汪汇 方帆 宋艳玲 芦立轩 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期199-204,共6页
目的构建表达小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因的慢病毒载体,体外感染原代培养的C57BL/6小鼠神经膜细胞,观察是否提高AQP1的表达,为进一步研究AQP1与周围神经系统损伤后水肿的关系奠定基础。方法将小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-c... 目的构建表达小鼠水通道蛋白1(AQP1)基因的慢病毒载体,体外感染原代培养的C57BL/6小鼠神经膜细胞,观察是否提高AQP1的表达,为进一步研究AQP1与周围神经系统损伤后水肿的关系奠定基础。方法将小鼠AQP1基因克隆到慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。将鉴定后的重组表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1与包装质粒psPAX2、pMD共转染293T细胞,制备携带AQP1基因的慢病毒lentivirus-AQP1。体外培养C57BL/6小鼠的神经膜细胞,将lentivirus-AQP1感染神经膜细胞,RT-PCR和蛋白质印迹法检测感染后神经膜细胞AQP1 mRNA和蛋白的表达情况。结果构建的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-AQP1经PCR鉴定和测序正确。慢病毒lentivirus-AQP1感染神经膜细胞后AQP1表达增加(P<0.05)。结论成功构建了小鼠AQP1基因的慢病毒表达载体,该载体能有效感染神经膜细胞,使AQP1 mRNA和蛋白表达水平增高。 展开更多
关键词 水通道蛋白1 过表达 慢病毒 神经膜细胞
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提高基因工程中重组蛋白质表达效率及可溶性产物的一种新方法 被引量：6
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作者 杨瑞 王淑秀 +1 位作者 陈正跃 秦川 《中国临床康复》 CSCD 北大核心 2006年第29期92-93,共2页
目的:建立一种使基因工程中重组蛋白质高效表达并提高可溶性比率的新方法。方法:2002-09/2005-03在新乡医学院分子生物研究室用不含葡萄糖的M9ZB培养基分别培养转化过的含Tac启动子或T7启动子的工程菌,采用终浓度为0.02mmol/L的IPTG及5m... 目的:建立一种使基因工程中重组蛋白质高效表达并提高可溶性比率的新方法。方法:2002-09/2005-03在新乡医学院分子生物研究室用不含葡萄糖的M9ZB培养基分别培养转化过的含Tac启动子或T7启动子的工程菌,采用终浓度为0.02mmol/L的IPTG及5mmol/L的乳糖进行诱导。采用SDS-PAGE及岛津薄层扫描分析仪进行表达效率检测、蛋白可溶性的扫描分析。结果:用常规方法(1mmol/LIPTG,LB培养基)诱导,重组基因的表达效率不高,表达量占菌体总蛋白25%,且可溶性产物比例较低,占表达蛋白的20%,采用0.02mmol/L的IPTG及5mmol/L乳糖诱导后重组蛋白表达效率占菌体总蛋白的65%,可溶性产物比例亦大幅升高占表达蛋白90%～93%,此方法没有选择性,对T7启动子表达系统和Tac启动子表达系统均有效。结论:采用0.02mmol/L的IPTG及5mmol/L乳糖诱导后,不仅使含Tac启动子或T7启动子的表达系统中重组蛋白表达增加而且产物可溶性升高。 展开更多
关键词 基因 基因表达 重组蛋白质类
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端粒酶转染大鼠胰岛素分泌细胞建立的永生化细胞系 被引量：3
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作者 任甫 侯续伟 +1 位作者 徐国昌 尹波 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2009年第33期6500-6504,共5页
背景:在前期DNA重组技术构建端粒酶反转录酶基因真核表达的质粒、端粒酶反转录酶基因基因转染大鼠胰岛素分泌细胞的基础上,得到永生化的胰岛素分泌细胞系,建立了稳定一致的细胞模型。目的:端粒酶转染健康成年SD大鼠的胰岛素分泌细胞,建... 背景:在前期DNA重组技术构建端粒酶反转录酶基因真核表达的质粒、端粒酶反转录酶基因基因转染大鼠胰岛素分泌细胞的基础上,得到永生化的胰岛素分泌细胞系,建立了稳定一致的细胞模型。目的:端粒酶转染健康成年SD大鼠的胰岛素分泌细胞,建立均一稳定的胰岛素分泌细胞系,为临床胰岛素分泌细胞移植治疗糖尿病奠定实验基础。设计、时间及单位:动物实验观察,2007-02/05在辽宁医学院人类学研究所完成。材料:健康成年SD大鼠20只,取其胰岛细胞的分离、纯化、培养及鉴定。方法:原代培养健康成年SD大鼠的胰岛素分泌细胞,采用Ⅴ型胶原酶消化和Ficoll400纯化液纯化。经双硫腙染色和高效液相色谱分离及质谱分析的方法对分离得到的胰岛素分泌细胞进行检测。采用含有端粒酶反转录酶基因的载体转染大鼠胰岛素分泌细胞,经G418筛选后得到阳性细胞克隆,并在体外进行连续的传代培养。应用RT-PCR方法检测hTERT基因在细胞中的整合和表达情况,同时用高效液相色谱分离法对转染后的细胞分泌胰岛素的功能进行检测。主要观察指标:①胰岛细胞在经过端粒酶反转录酶基因转染前后的细胞生长情况。②转染后的细胞在体外的传代培养情况。③细胞的胰岛素分泌情况。结果:端粒酶反转录酶基因转染后细胞与未转染的细胞对比活力良好并且仍有分泌胰岛素的功能,可在体外连续的进行传代培养(目前已传至第15代,仍在进一步传代培养中),同时外源性的hTERT基因在转染后的胰岛素分泌细胞中有稳定的整合并表达。结论:转染后的细胞具有分泌胰岛素的功能并可以在体外连续传代培养,端粒酶反转录酶基因在胰岛素分泌细胞中稳定的整合并表达,胰岛素分泌细胞的永生化细胞系基本建立。 展开更多
关键词 端粒酶 转染 胰岛细胞 永生化
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TLR3基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 被引量：2
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作者 喻钧 潘铁成 +2 位作者 魏翔 刘立刚 胡敏 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期167-171,共5页
目的观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人肺腺癌细胞株A549细胞Toll样受体3(Toll-likereceptor 3,TLR3)表达的影响,为后续的以TLR3基因为靶点的肺癌研究和治疗奠定基础。方法应用基因工程技术,筛选出4条针对TLR3基因的RNAi靶序列... 目的观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰(RNAi)对人肺腺癌细胞株A549细胞Toll样受体3(Toll-likereceptor 3,TLR3)表达的影响,为后续的以TLR3基因为靶点的肺癌研究和治疗奠定基础。方法应用基因工程技术,筛选出4条针对TLR3基因的RNAi靶序列,分别与pCCL-GFP载体连接,构建4个重组慢病毒表达载体TLR3-RNAi-LV 1#,TLR3-RNAi-LV 2#,TLR3-RNAi-LV 3#,TLR3-RNAi-LV 4#;将连接产物转化到DH5α感受态细胞,经PCR筛选阳性克隆、测序鉴定。将TLR3-RNAi-LV、pHelper 1.0、pHelper 2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。将包装产生的4种重组慢病毒分别感染A549细胞,实时定量PCR和Western印迹检测A549细胞TLR3mRNA和蛋白的表达。根据筛选的结果,选取最有效的载体进行病毒的大量包装。结果 4个慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度分别为2×108、2×108、2×108、1×108 TU/mL。感染A549细胞后,TLR3基因mRNA和蛋白的表达量与未感染慢病毒的细胞组及空载体感染组相比均明显下降(均P<0.05),其中TLR3-RNAi-LV 4#作用较明显,使mRNA表达下降80%,蛋白表达下降68%(均P<0.05)。4#病毒载体大量包装后其滴度为1×109 TU/mL。结论成功构建针对TLR3基因的4个慢病毒载体TLR3-RNAi-LV,体外感染A549细胞后可有效抑制TLR3基因和蛋白的表达。 展开更多
关键词 TOLL样受体3 RNA干扰 慢病毒 肺腺癌
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聚氨基酯载基因纳米粒的研究 被引量：2
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作者 王江峰 鲁莹 +3 位作者 黄景彬 邹豪 张翮 钟延强 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期473-476,共4页
目的合成一种新型阳离子聚合物聚氨基酯(PBAE),并以此作为基因载体进行研究。方法通过迈克尔加成反应合成PBAE,以自主装法制备PBAE/pDNA纳米复合物,并考察PBAE/pDNA纳米复合物在HEK293细胞中的转染效率。结果当PBAE/pDNA的质量比为50∶1... 目的合成一种新型阳离子聚合物聚氨基酯(PBAE),并以此作为基因载体进行研究。方法通过迈克尔加成反应合成PBAE,以自主装法制备PBAE/pDNA纳米复合物,并考察PBAE/pDNA纳米复合物在HEK293细胞中的转染效率。结果当PBAE/pDNA的质量比为50∶1时,pDNA被完全包裹;在HEK293细胞转染实验中,当PBAE/pDNA质量比为200∶1时,其转染效率高于阳性对照组PEI/pDNA的转染效率(43.3%±3.7%vs 30.3%±2.1%,P<0.05)。结论带正电荷的PBAE能够通过静电作用浓缩包裹pDNA,在体外转染实验中具有较高的转染效率。 展开更多
关键词 聚氨基酯 纳米粒 转染效率 基因载体
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轻链替换文库对抗HBs基因工程Fab抗体亲和力的影响 被引量：2
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作者 刘雪林 唐晓敏 +1 位作者 李申龙 宋宏彬 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期770-772,共3页
目的测定轻链替换文库对基因工程Fab抗体的亲和力的影响。方法将PCR扩增的人抗体轻链基因插入已克隆有人源抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体重链Fd基因的噬菌粒中，构建成轻链替换文库，经亲和淘洗，从该文库中筛选与重链Fd基因相匹配的轻... 目的测定轻链替换文库对基因工程Fab抗体的亲和力的影响。方法将PCR扩增的人抗体轻链基因插入已克隆有人源抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体重链Fd基因的噬菌粒中，构建成轻链替换文库，经亲和淘洗，从该文库中筛选与重链Fd基因相匹配的轻链基因。结果链替换的噬菌体抗体（phab）的ELISA光吸收值（A）从0．43±0．09提高到最高为1．24±0．10。序列分析ELISA光吸收值（A）最高的5株phab的轻链基因，3株κ链的碱基序列基本一致，属ⅤκⅢ亚群，2株λ链的基因序列相同，属ⅤλⅠ亚群。结论所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。 展开更多
关键词 链替换 噬菌体抗体 肝炎表面抗原 乙型 抗体亲和力
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应用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒 被引量：7
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作者 徐爱晶 李堂 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1277-1280,共4页
目的:AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞获得重组病毒,极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组... 目的:AdEasy系统可在原核细胞E.coli BJ5183中完成穿梭质粒与骨架质粒之间的高效同源重组,经抗生素培养板筛选重组体,然后转染293细胞获得重组病毒,极大简化了载体的构建过程。实验利用AdEasy腺病毒载体系统构建鼠白细胞介素10基因重组腺病毒。方法:实验于2006-08/2007-05在青岛大学医学院病毒学实验室完成。①实验材料:清洁级SD大鼠5只,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,骨架质粒pAdeasy-1,大肠杆菌BJ5183和DH10B,人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物教研室罗兵教授惠赠。②实验方法:从脂多糖刺激培养的大鼠脾细胞中提取细胞总RNA,应用反转录多聚酶链反应技术扩增白细胞介素10cDNA,定向亚克隆至pAdtrack-CMV中构建腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-IL-10,酶切线性化后转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy的BJ5183大肠杆菌中,获得重组腺病毒质粒pAd-IL-10,Lipofectamin包装转染293细胞,获得重组腺病毒vAd-IL-10,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。将293细胞接种于96孔板中,每孔1×104个细胞,浓缩后的病毒贮存液按不同比例稀释加至培养板中,测定重组腺病毒滴度。用重组腺病毒vAd-IL-10感染293细胞3d后,以TRIzol一步法提取细胞总RNA,所获RNA加入DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA后,PCR产物行琼脂糖电泳检测白细胞介素10 mRNA的表达。结果:①重组腺病毒的包装及滴度测定:经限制性内切酶转染293细胞16h后,荧光显微镜观察到细胞中有GFP荧光,可间接反映目的基因的表达。将病毒上清反复感染293细胞扩增重组腺病毒,通常传至第4～5代于接种病毒后24～48h,几乎可观察到所有细胞出现荧光,此时收获病毒,重组病毒命名为vAd-IL-10。vAd-IL-10滴度为5.5×108pfu/mL,vAd-GFP滴度为9.0×108pfu/mL。②目的基因RT-PCR产物的鉴定:提取重组腺病毒感染293细胞总RNA,RT-PCR扩增后琼脂糖电泳显示特异性580bp预计大小的片段,表明该重组腺病毒可在293细胞中有效转录。结论:利用AdEasy腺病毒载体系统成功构建了携带白细胞介素10基因的重组腺病毒载体,并制备出高滴度的重组腺病毒vAd-IL-10,可在293细胞中有效转录。 展开更多
关键词 基因工程 腺病毒 白细胞介素10 组织构建
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人类基因变异组计划及其在肿瘤方面研究进展 被引量：5
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作者 邵营波 张瑾 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第23期2706-2709,共4页
肿瘤是一种基因疾病的观点已被广泛接受。然而到目前为止,仅有一小部分的基因变异得到证实,获得的信息非常有限。而那些在肿瘤发生、发展过程中起关键作用的基因变化还不明确,这就亟须建立一个完善的系统来收集、记录、储存这些变异基... 肿瘤是一种基因疾病的观点已被广泛接受。然而到目前为止,仅有一小部分的基因变异得到证实,获得的信息非常有限。而那些在肿瘤发生、发展过程中起关键作用的基因变化还不明确,这就亟须建立一个完善的系统来收集、记录、储存这些变异基因信息以指导肿瘤临床实践和基础研究。2006年,人类基因变异组计划(HVP)正式启动,HVP是一项浩大的首创性国际合作工程,旨在收集所有与人类疾病相关的遗传变异,使得全世界的临床医生和科学家能够共享这些疾病相关遗传数据,应用于临床诊断和研究中。HVP为肿瘤及其他疾病的研究开辟了新的道路。 展开更多
关键词 人类基因变异组计划 肿瘤 变异 突变
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