携带人野生型PKGⅠα基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定 被引量：4

1

作者 易斌 陆俊羽 +2 位作者 白莉 王关嵩 钱桂生 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期69-72,共4页

目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack-PKGⅠα,然后分别... 目的:克隆人PKGⅠa基因,构建其重组腺病毒载体。方法:用RT-PCR方法从人肺动脉平滑肌组织中扩增PKGⅠa基因全长,经T/A克隆后,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα。PmeⅠ酶切pAdTrack-PKGⅠα,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pAdTrack-PKGⅠα转化至BJ5183感受态细菌中进行同源重组,PacⅠ酶切线性化重组质粒AdCMV-PKGⅠα后转染Ad293细胞进行病毒包装和扩增。检测PKGⅠα基因的表达,并用绿色荧光蛋白(GFP)法测定其滴度。结果:用RT-PCR方法,从人肺动脉中层扩增出PKGⅠα,测序证实为人PKGⅠα基因。构建了PKGⅠα基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒保存液。结论:成功地克隆了人PKGⅠα基因,并构建其重组腺病毒载体,为进一步研究PKGⅠα基因在低氧肺血管重建中的作用提供了有效的基因转移载体。 展开更多

关键词 PKGⅠα基因 腺病毒载体 基因克隆 DNA重组

原文传递

携带半乳糖苷酶报告基因重组腺相关病毒体内转染骨组织的实验观察 被引量：4

2

作者 杨民 党耕町 马庆军 《中国组织工程研究与临床康复》 CAS CSCD 北大核心 2007年第19期3677-3680,共4页

目的:腺相关病毒载体因具有安全性好、免疫源性低、能感染分裂和非分裂细胞且能介导外源基因稳定长期表达等优点而备受瞩目,是最有希望应用于临床的病毒类载体。观察携带半乳糖苷酶报告基因的重组腺相关病毒(rAAV-LacZ)体内转染骨组织... 目的:腺相关病毒载体因具有安全性好、免疫源性低、能感染分裂和非分裂细胞且能介导外源基因稳定长期表达等优点而备受瞩目,是最有希望应用于临床的病毒类载体。观察携带半乳糖苷酶报告基因的重组腺相关病毒(rAAV-LacZ)体内转染骨组织的效果。方法:实验于2005-01/2006-01在北京大学医学部第三医院和皖南医学院弋矶山医院骨科实验室完成。实验材料:8周龄雄性SD大鼠8只,体质量220g左右。rAAV-LacZ载体(本元正阳公司,病毒滴度为6×1012v·g/mL);Ⅰ型胶原海绵载体(上海其胜公司)。实验分组:将大鼠随机分为实验组和对照组,每组4只。实验方法:实验组4只大鼠在胫骨前外侧做骨缺损槽后,将滴有6×1011v·g病毒量的rAAV-LacZ和Ⅰ型胶原载体复合物植入骨缺损槽;对照组4只大鼠仅在胫骨骨缺损槽内植入Ⅰ型胶原载体。实验评估:①手术后6周取材行x-gal染色后,分别行标本大体病理观察和组织学观察以了解β-半乳糖苷酶特异表达的情况。②同时提取实验部位以远器官肝和心脏组织RNA,反转录-聚合酶链反应检测这些部位有无β-半乳糖苷酶特异表达。结果:8只SD大鼠均进入结果分析。①大体病理观察结果:实验组动物胫骨骨缺损处取材经x-gal染色后可见骨质蓝染,即有特异性β-半乳糖苷酶表达,而骨缺损临近处肌肉也表达β-半乳糖苷酶,Ⅰ型胶原载体植入部位以远的骨质和肌肉则没有特异性β-半乳糖苷酶的表达。②组织学观察结果:实验组骨缺损处肌肉肌纤维特异性表达β-半乳糖苷酶且没有明显的淋巴细胞局部浸润。蓝染的骨皮质切片显示骨陷窝内的骨细胞特异性表达β-半乳糖苷酶。对照组则没有实验组上述特异性β-半乳糖苷酶的表达。③反转录-聚合酶链反应结果:实验组实验部位有特异性β-半乳糖苷酶的表达,而其以远的心、肝器官内没有特异性β-半乳糖苷酶的表达。而对照组实验部位和实验部位以远的心、肝器官内均没有特异性β-半乳糖苷酶的表达。结论:腺相关病毒载体直接注射到骨缺损和骨折部位可以有效转染骨和临近肌肉组织,并能长期(6周)表达所携带的外源基因,具有一定的安全性。 展开更多

关键词 腺病毒科 骨折愈合 基因疗法 组织构建

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核心结合因子α1重组慢病毒感染牙周膜成纤维细胞骨向分化的实验研究 被引量：3

3

作者 曹金芳 王惠宁 +2 位作者 潘乙怀 李伟宏 邓辉 《口腔医学》 CAS 2010年第12期716-718,724,共4页

目的观察含人核心结合因子α1(Core binding factor α1,CBFα1)基因的重组慢病毒感染对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)骨向分化的影响。方法将PDLFs分为3组:A组为未感染任何病毒的细胞组;B组为加... 目的观察含人核心结合因子α1(Core binding factor α1,CBFα1)基因的重组慢病毒感染对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)骨向分化的影响。方法将PDLFs分为3组:A组为未感染任何病毒的细胞组;B组为加阴性对照病毒感染的细胞组;C组为加CBFα1重组慢病毒感染的细胞组。应用免疫细胞化学的方法检测目的基因CBFα1在PDLFs中的表达,观察碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性和矿化结节形成,评价各组细胞骨向分化的情况。结果免疫细胞化学检测证实了CBFα1在PDLFs中的有效表达。ALP活性检测和矿化结节染色均证实C组细胞骨向分化能力明显高于对照组。结论携带CBFα1基因的重组慢病毒可有效感染PDLFs,并促进其骨向分化,感染的CBFα1得到了有效表达。 展开更多

关键词 核心结合因子Α1 牙周膜成纤维细胞 慢病毒 感染

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能合成和分泌GABA的永生化神经前体细胞的构建 被引量：2

4

作者 笱玉兰 朱遂强 +3 位作者 陈国华 张继龙 罗利俊 阮旭中 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期721-724,846,共5页

目的构建能合成和分泌γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)且可以无限增殖的永生化神经前体细胞。方法在永生化的神经前体细胞中转入含有GABA合成限速酶谷氨酸脱羧酶65亚型(glutamate decarboxylase 65,GAD65)的基因,用免疫组织化学... 目的构建能合成和分泌γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)且可以无限增殖的永生化神经前体细胞。方法在永生化的神经前体细胞中转入含有GABA合成限速酶谷氨酸脱羧酶65亚型(glutamate decarboxylase 65,GAD65)的基因,用免疫组织化学、Western blot、毛细管电泳等方法观察GABA的合成和分泌。结果与对照组相比,INPCs-GAD65的含量明显增加。合成和释放的GABA显著增加,并能记录到GABA电流。结论成功构建了能合成和分泌GABA的永生化的神经前体细胞。 展开更多

关键词 谷氨酸脱羧酶65亚型 Γ-氨基丁酸 神经前体细胞

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人源性防御素HD-5的原核表达及抗真菌作用的初步研究 被引量：1

5

作者 张萍萍 尹利荣 +2 位作者 王芳 孙蓓 霍彦 《天津医药》 CAS 北大核心 2014年第8期755-758,共4页

目的构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴... 目的构建pQE-30Xa/HD-5原核表达载体,纯化重组蛋白并进行抗真菌活性的初步鉴定。方法以pcDNA3.1(+)/HD-5为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增编码HD-5成熟肽的基因。构建pQE-30Xa/HD-5重组表达载体,并对重组质粒进行酶切、基因序列分析。将鉴定正确的质粒转化入大肠杆菌M15后进行异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。通过镍柱亲和层析纯化蛋白并进行蛋白复性,蛋白免疫印迹(Western blot)鉴定纯化产物。以KB纸片法初步验证纯化获得的重组蛋白对白色假丝酵母菌的抑菌活性。结果成功克隆了HD-5基因并构建了重组质粒pQE-30Xa/HD-5。重组质粒在大肠杆菌M15中诱导表达出HD-5融合蛋白;Western blot分析结果显示纯化后的融合蛋白与目的蛋白相符;KB纸片法证实纯化后的融合蛋白对白色假丝酵母菌具有一定的抑菌活性。结论成功构建HD-5原核表达载体,经诱导表达后纯化获得具有良好抑菌活性的HD-5融合蛋白。 展开更多

关键词 防御素类 重组融合蛋白质类 大肠杆菌 防御素-5 原核表达 亲和层析 抗真菌活性

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腺病毒介导的人诱变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响 被引量：1

6

作者 陈娓 张红亚 +4 位作者 郭寿贵 王月刚 韦莉莉 刘城 吴平生 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期576-578,581,共4页

目的探讨腺病毒介导的人诱变型低氧诱导因子1(简称Ad-H564)在大鼠急性后肢缺血模型中的表达及促进血管新生的作用。方法①重组腺病毒在HEK293A细胞内大量扩增,氯化铯浓度梯度离心,透析纯化后用分光光度计法测定病毒滴度。②建立大鼠急... 目的探讨腺病毒介导的人诱变型低氧诱导因子1(简称Ad-H564)在大鼠急性后肢缺血模型中的表达及促进血管新生的作用。方法①重组腺病毒在HEK293A细胞内大量扩增,氯化铯浓度梯度离心,透析纯化后用分光光度计法测定病毒滴度。②建立大鼠急性后肢缺血动物模型,将72只大鼠随机均分为4组:Ad-LacZ组、Ad-HIF1α0组、Ad-HIF1α564组和对照组,其中在测定HIF-1αmRNA表达时取生理盐水组作为对照组,在血管造影和铸型时取假手术组作为对照组。实验组分别以Ad-LacZ、Ad-H0和Ad-H564转染术侧后肢骨骼肌,对照组注射生理盐水,假手术组不做任何处理。③于转染后1、3、5、7d,以生理盐水组为对照,采用RT-PCR法测定肌肉中的HIF-1 mRNA表达;④基因转染后28d,以假手术组为对照,选择性后肢动脉造影及血管铸型观察血管密度。结果①经PCR及基因测序鉴定,扩增纯化后的腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异,病毒滴度达1011OPU/ml。②RT-PCR结果显示:Ad-H564组基因相对表达量最高(平均0.5447±0.1412),与生理盐水组,Ad-LacZ组相比差异有统计学意义(P=0.000),但与Ad-H0组(平均0.5330±0.0416)的差异不显著(P=0.368);各组均以基因转染后7d表达量最高,Ad-H564组与其他各组对照间差异有统计学意义(P=0.000)。③基因转染28d后造影结果显示:Ad-H564组和Ad-H0组的侧支血管密度均大于对照组,但两组间无显著差异。动脉血管铸型结果显示:Ad-H564组的微小血管密度较其他各组明显增多。结论单一位点诱变型人HIF-1α基因能够增强局部肌肉内基因表达,促进缺血组织中血管新生,但与野生型基因相比差异无统计学意义。 展开更多

关键词 腺病毒科 低氧诱导因子1Α 血管新生

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含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定 被引量：1

7

作者 索磊 杨印祥 栾佐 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第24期2962-2966,共5页

目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月,根据Gen Bank数据库中报道的人LINGO-1基因序列,设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列,并将其克隆至重组质粒载体,测... 目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体,并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月,根据Gen Bank数据库中报道的人LINGO-1基因序列,设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列,并将其克隆至重组质粒载体,测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组),并转染至人胶质细胞瘤细胞U251,荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应(q PCR)法检测LINGO-1 mRNA表达水平,采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体,经过包装分别得到滴度为2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后,实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示,人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1,经慢病毒载体转染后,实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平(0.09±0.01)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=12.87,P<0.01),实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。实验组LINGO-1表达水平(0.28±0.02)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。结论本研究成功构建了含人LINGO-1shRNA干扰载体,并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果,为研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 慢病毒属 RNA干扰 LINGO-1

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人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

8

作者 余贻汉 杨道锋 +2 位作者 谢林卡 朱慧芬 沈关心 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期130-133,共4页

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体... 目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。 展开更多

关键词 人转化生长因子β 受体 转染 重组

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人巨细胞病毒UL123基因外显子4诱饵质粒的构建与鉴定

9

作者 文兰 李一柯 +1 位作者 陈利玉 罗敏华 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期689-691,共3页

目的构建和鉴定人巨细胞病毒(HCMV)UL123基因外显子4(ie1-exon4)的诱饵质粒,并评价其用于细菌双杂交系统筛选文库的可行性。方法以重组质粒pTWIN1/ie1为模板扩增ie1-exon4,克隆入pBT质粒,转化E.coliXL1-BlueMRF’Kan,经PCR、限制性酶切... 目的构建和鉴定人巨细胞病毒(HCMV)UL123基因外显子4(ie1-exon4)的诱饵质粒,并评价其用于细菌双杂交系统筛选文库的可行性。方法以重组质粒pTWIN1/ie1为模板扩增ie1-exon4,克隆入pBT质粒,转化E.coliXL1-BlueMRF’Kan,经PCR、限制性酶切和测序鉴定阳性重组子,提取阳性重组质粒,再转化入细菌双杂交系统报告菌株,诱导表达重组融合蛋白,用SDS-PAGE和WesternBlot对表达产物进行鉴定,并进一步鉴定重组子自身激活作用。结果细菌双杂交诱饵质粒pBT/ie1-exon4构建成功,并在报告菌株中表达了重组融合蛋白rIE1-C86-491/λC1,且pBT/ie1-exon4无自身激活作用。结论成功构建了无自激活作用的诱饵质粒pBT/ie1-exon4,可用于筛选文库。 展开更多

关键词 人巨细胞病毒 外显子4 克隆 细菌双杂交系统

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重组PCR构建不同CAG重复的雄激素受体基因载体

10

作者 阴大伟 叶玲 +2 位作者 李小鹰 刘建伟 杨立娜 《军医进修学院学报》 CAS 北大核心 2008年第1期1-3,共3页

目的:构建不同CAG重复的人雄激素受体(hAR)基因载体用于真核细胞表达。方法:以CAG重复数目为CAG8,CAG21,CAG34的白细胞基因为模板,扩增含相应CAG重复的中间片段。以克隆有野生型hAR基因的质粒为模板扩增上、下游片段,并与中间片段进行重... 目的:构建不同CAG重复的人雄激素受体(hAR)基因载体用于真核细胞表达。方法:以CAG重复数目为CAG8,CAG21,CAG34的白细胞基因为模板,扩增含相应CAG重复的中间片段。以克隆有野生型hAR基因的质粒为模板扩增上、下游片段,并与中间片段进行重组PCR,拼接的目的片段经SalⅠ-NruⅠ酶切后置换质粒中相应片段,构建含不同CAG重复的载体。结果:构建后的载体经酶切和DNA测序,证实CAG重复数目为8,21,34的表达载体大小和序列正确。结论:重组PCR技术是体外基因重组的一种有效、可行的方法。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 受体 雄激素 CAG重复

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ZEB2基因3′UTR区转染对人胃黏膜上皮细胞GES-1增殖、侵袭、迁移的影响 被引量：6

11

作者 李素丽 周芳 +4 位作者 张庆瑜 贾文亮 张安玲 韩磊 康春生 《天津医药》 CAS 北大核心 2014年第5期401-405,I0001,共6页

目的探讨E盒结合锌指蛋白(ZEB)2基因3′非翻译区(3′UTR)转染人胃黏膜上皮细胞GES-1后对其增殖、侵袭、迁移的影响。方法将人工合成的ZEB2 3′UTR质粒及miR-200b micmics采用脂质体Lipofectamine2000转染GES-1细胞。分别设对照组、突变... 目的探讨E盒结合锌指蛋白(ZEB)2基因3′非翻译区(3′UTR)转染人胃黏膜上皮细胞GES-1后对其增殖、侵袭、迁移的影响。方法将人工合成的ZEB2 3′UTR质粒及miR-200b micmics采用脂质体Lipofectamine2000转染GES-1细胞。分别设对照组、突变组和ZEB2 3′UTR组,qRT-PCR检测转染后miR-200a/b/c及ZEB1/ZEB2mRNA的表达。再设对照组、ZEB2 3′UTR组、ZEB2 3′UTR+无义序列组和ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics组。West-ern blot检测转染后ZEB1/ZEB2、基质金属蛋白酶(MMP)-2/9、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达;Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞侵袭迁移能力;MTT法检测细胞增殖活性。结果与对照组及突变组相比,转染ZEB2 3′UTR组miR-200a/b/c的表达均下调,以miR-200b最为明显,ZEB1/ZEB2 mRNA及蛋白水平表达上调,其细胞迁移、侵袭、增殖活性均增强(P<0.05)。ZEB2 3′UTR+miR-200b micmics组较ZEB2 3′UTR组迁移、侵袭、增殖活性降低。结论ZEB2 3′UTR可能通过调控miR-200a/b/c的表达进而影响其对靶基因的转录后调控,增加细胞的侵袭、迁移能力,导致GES-1细胞的恶性转化倾向。 展开更多

关键词 3′非翻译区 转染 胃黏膜 上皮细胞 细胞增殖 肿瘤转移 E盒结合锌指蛋白

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TMEM88真核表达质粒的构建及其功能研究 被引量：2

12

作者 倪升丽 胡富勇 +3 位作者 李增 孟晓明 王学富 徐涛 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第6期839-842,共4页

目的构建TMEM88的真核表达质粒,并研究其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法提取人肝星状细胞的总RNA,逆转录成cDNA作为模板,利用PCR法扩增出TMEM88的CDS序列,双酶切后连接到pEGFP-C2载体上,然后进行转化、质粒抽提、酶切鉴定,最后挑取... 目的构建TMEM88的真核表达质粒,并研究其对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法提取人肝星状细胞的总RNA,逆转录成cDNA作为模板,利用PCR法扩增出TMEM88的CDS序列,双酶切后连接到pEGFP-C2载体上,然后进行转化、质粒抽提、酶切鉴定,最后挑取阳性克隆送生物公司测序。将pEGFP-C2-TMEM88真核表达质粒分别转染至人肝癌细胞株SMMC-7721中,通过MTT实验和流式细胞术检测其对细胞增殖和凋亡的影响。结果测序结果显示pEGFP-C2-TMEM88真核表达质粒构建成功;MTT实验结果显示,过表达组细胞的增殖率为(0.625±0.07),显著低于正常组的(0.880±0.09)(P<0.05);流式细胞术结果显示,过表达组细胞的凋亡率为22.1%,显著高于正常组的9.1%。结论 TMEM88能够显著抑制人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖,并促进其凋亡,为进一步了解TMEM88的功能、寻求肝癌治疗的新方向奠定了基础。 展开更多

关键词 TMEM88 转染 增殖 凋亡

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慢病毒介导的shRNA干扰大鼠施万细胞RSC96 MYH14基因的表达 被引量：1

13

作者 胡皓 孟威 +4 位作者 刘安堂 汪汇 朱晓海 江华 钱玉鑫 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期1132-1137,共6页

目的应用RNA干扰技术构建大鼠肌球蛋白重链14(MYH14)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法根据MYH14 mRNA序列设计合成单链引物形成双链寡核苷酸序列,连接入经AgeⅠ和BamHⅠ双酶切线性化的GV298慢病毒质粒载体中,菌液经PCR鉴定并测序验证。... 目的应用RNA干扰技术构建大鼠肌球蛋白重链14(MYH14)基因重组慢病毒载体并鉴定。方法根据MYH14 mRNA序列设计合成单链引物形成双链寡核苷酸序列,连接入经AgeⅠ和BamHⅠ双酶切线性化的GV298慢病毒质粒载体中,菌液经PCR鉴定并测序验证。取测序正确的菌液提取质粒转染大鼠施万细胞RSC96,利用免疫荧光法观察转染效率,蛋白质印迹法筛选有效敲低MYH14的shRNA质粒,CCK-8法检测转染后RSC96细胞的活力。结果合成3对MYH14-shRNA序列并将其克隆到GV298载体中,构建了重组质粒MYH14-shRNA1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序筛选出测序正确的载体MYH14-shRNA1和MYH14-shRNA2。免疫荧光检测结果显示转染72 h时RSC96细胞荧光表达最强;蛋白质印迹法检测结果显示,与阴性对照(scramble序列)组相比,MYH14-shRNA2转染后RSC96细胞中MYH14蛋白的表达水平降低(0.57±0.15 vs 1.11±0.06,P<0.01),而MYH14-shRNA1转染后MYH14蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。MYH14-shRNA2转染RSC96细胞24 h后的细胞活力与阴性对照组相比差异无统计学意义(1.09±0.16 vs 1.00±0.15,P>0.05)。结论成功构建大鼠MYH14基因重组慢病毒干扰载体,该载体能有效下调RSC96细胞中MYH14的表达。 展开更多

关键词 肌球蛋白重链14 短发夹RNA 慢病毒 施万细胞

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真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究 被引量：2

14

作者 耿洁 刘涛 +3 位作者 姜锦 李光 黄志伟 王玉亮 《天津医药》 CAS 北大核心 2020年第8期711-714,共4页

目的构建含可诱导共刺激分子(ICOS)融合蛋白(ICOSIg)基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)中表达。方法克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真... 目的构建含可诱导共刺激分子(ICOS)融合蛋白(ICOSIg)基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)中表达。方法克隆编码大鼠ICOS的胞外片段,将其与编码人免疫球蛋白IgG Fc段的基因融合,构建ICOSIg融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1(+)/ICOSIg。经测序鉴定后转染ADSCs,Western blot法检测ICOSIg在ADSCs中的表达。结果经测序鉴定验证pcDNA3.1(+)/ICOSIg质粒构建成功,且能在ADSCs中成功表达。结论ICOSIg在ADSCs中成功表达,为进一步研究免疫耐受机制提供了实验基础。 展开更多

关键词 间充质基质细胞 受体 Fc 基因融合 质粒 可诱导共刺激分子 真核表达载体 脂肪间充质干细胞

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丁苯酞对脂肪源性神经元细胞凋亡的作用 被引量：1

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作者 陆艳卉 李斌 +3 位作者 王彦 周桂娟 纪茹英 元小冬 《中国煤炭工业医学杂志》 2023年第4期337-345,共9页

目的观察丁苯酞对成人脂肪基质细胞(ADSC)来源神经元细胞凋亡的影响。方法本研究时间为2019年4月—2020年12月。脂肪基质细胞在β-巯基乙醇诱导下分化为神经元,诱导后细胞分为未加丁苯酞组和加丁苯酞组,每组记录诱导1h、3h、5h、8h四个... 目的观察丁苯酞对成人脂肪基质细胞(ADSC)来源神经元细胞凋亡的影响。方法本研究时间为2019年4月—2020年12月。脂肪基质细胞在β-巯基乙醇诱导下分化为神经元,诱导后细胞分为未加丁苯酞组和加丁苯酞组,每组记录诱导1h、3h、5h、8h四个时间点。未加丁苯酞组与加丁苯酞组均通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测NSE、NF-200、GFAP、caspase-3,MTT检测神经元细胞的生长曲线,TUNEL法检测细胞凋亡。结果未加丁苯酞组及加丁苯酞组诱导后ADSC均呈典型的神经元形态,电镜下一些神经元细胞的胞体回缩,胞核表面不光滑,核膜回缩、细胞核碎裂,可见凋亡小体,线粒体出现肿胀、嵴断裂、线粒体膜断裂。两组神经元细胞NSE、NF-200表达为阳性。未加丁苯酞组NF-200及NSE随诱导时间延长阳性率逐渐增高,诱导5h达高峰,NSE及NF-200诱导8h与5h相比P>0.05,其余时间点两两比较P<0.05。加丁苯酞组NF-200及NSE诱导8h达高峰,NSE诱导8h与5h相比P>0.05,其余时间点两两比较P<0.05;加丁苯酞组NF-200各个时间点两两比较P<0.05。NSE及NF-200四个时间点两组之间P<0.05。GFAP表达为阴性。Caspase-3在二组中,随诱导时间延长阳性率逐渐升高,8h达高峰,且各个时间点两两比较和相同时间点两组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。二组TUNEL随诱导时间延长阳性表达率逐渐增高,8h达高峰,两组中各个时间点两两比较P<0.05,诱导1h时两组之间比较P>0.05,诱导3h、5h、8h两组之间比较P<0.05。二组MTT随诱导时间的延长细胞数量逐渐减少;未加丁苯酞组诱导3h与5h相比P>0.05,其余时间点两两比较P<0.05。加入丁苯酞组诱导后各时间点细胞数量差异有统计学意义(P<0.05),各时间点两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论细胞凋亡是脂肪基质细胞诱导分化为神经元过程中发生死亡的主要原因,丁苯酞对诱导后神经元细胞凋亡具有抑制作用。 展开更多

关键词 丁苯酞 成人ADSC 诱导分化 神经元

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OX40Ig修饰大鼠脂肪间充质干细胞的实验研究 被引量：2

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作者 黄志伟 刘涛 +3 位作者 陈晓波 耿洁 李光 王玉亮 《天津医药》 CAS 北大核心 2021年第10期1009-1013,共5页

目的构建含OX40融合蛋白(^(OX40Ig))基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)即ADSCs^(OX40Ig),探讨其在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法构建pcDNA3.1(+)/^(OX40Ig)融合基因表达载体,采用核转染技术转染大鼠ADSCs,Western blot检测AD... 目的构建含OX40融合蛋白(^(OX40Ig))基因修饰的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)即ADSCs^(OX40Ig),探讨其在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法构建pcDNA3.1(+)/^(OX40Ig)融合基因表达载体,采用核转染技术转染大鼠ADSCs,Western blot检测ADSCs中^(OX40Ig)表达水平。ADSCs与大鼠异基因淋巴细胞共培养后分为对照组(反应细胞+刺激细胞)、ADSCs组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs)及ADSCs^(OX40Ig)组(反应细胞+刺激细胞+ADSCs^(OX40Ig)),MTT法检测淋巴细胞增殖抑制率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测淋巴细胞内干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-10及转化生长因子(TGF)-βmRNA表达。结果经测序鉴定验证,pcDNA3.1(+)/^(OX40Ig)质粒构建成功,转染ADSCs后^(OX40Ig)蛋白呈高表达;与ADSCs组比较,ADSCs^(OX40Ig)显著增强异基因淋巴细胞增殖抑制率(P<0.05);对照组、ADSCs组及ADSCs^(OX40Ig)组的IFN-γmRNA相对表达水平依次降低,而IL-10、TGF-βmRNA相对表达水平依次升高(P<0.05)。结论ADSCs^(OX40Ig)较单纯ADSCs能更好地发挥对异基因淋巴细胞的免疫调节作用。 展开更多

关键词 间充质基质细胞 基因融合 免疫调节 OX40配体 脂肪间充质干细胞 真核表达载体

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大鼠胰岛素原基因转染肠道上皮细胞构建类胰岛B细胞系的研究

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作者 蒋琳 刘超 +3 位作者 刘翠萍 季旻珺 吴海玮 张洪慧 《中国全科医学》 CAS CSCD 2007年第24期2053-2054,2060,共3页

目的观察重组大鼠胰岛素原基因转染小鼠肠道上皮细胞(IEC-6)后,IEC-6的胰岛素表达情况。方法将IEC-6分为重组大鼠胰岛素原基因pCMV/proinsulin转染组(A组)、空载质粒pCMV转染组(B组)和未转染组(C组)。利用脂质体法将pCMV/proinsulin和p... 目的观察重组大鼠胰岛素原基因转染小鼠肠道上皮细胞(IEC-6)后,IEC-6的胰岛素表达情况。方法将IEC-6分为重组大鼠胰岛素原基因pCMV/proinsulin转染组(A组)、空载质粒pCMV转染组(B组)和未转染组(C组)。利用脂质体法将pCMV/proinsulin和pCMV分别转染IEC-6,用RT-PCR法检测转染后IEC-6胰岛素原基因mRNA的表达,并用超敏放免法测定转染后IEC-6的胰岛素表达水平。结果pCMV/proinsulin转染IEC-6后,IEC-6能表达胰岛素原基因mRNA。3组IEC-6表达的胰岛素水平间差别有统计学意义(P<0.05)。A组IEC-6胰岛素表达水平与B组、C组比较,差别有统计学意义(P<0.001);B组IEC-6胰岛素表达水平与C组比较,差别无统计学意义(P>0.05)。结论重组大鼠胰岛素原基因能成功转染小鼠肠道细胞并分泌胰岛素,为开展糖尿病基因治疗的研究奠定了实验基础。 展开更多

关键词 转染 肠道上皮细胞 类胰岛B细胞系

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人S100A8基因重组慢病毒表达载体的构建

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作者 杨小燕 金皎 +9 位作者 黄璟 许键炜 吴莎莎 马健娟 李燕 庹媛媛 杨红兰 潘海新 胡绍燕 何志旭 《贵州医科大学学报》 CAS 2017年第11期1270-1273,共4页

目的:构建人S100A8基因高表达的重组慢病毒表达载体。方法:以正常人骨髓单个核细胞的c DNA为扩增模板,克隆S100A8基因全长的c DNA,与p MD19-T载体连接后进行测序鉴定;将p LVX-IRES-puro目的载体与测序正确的S100A8片段进行连接,筛选阳... 目的:构建人S100A8基因高表达的重组慢病毒表达载体。方法:以正常人骨髓单个核细胞的c DNA为扩增模板,克隆S100A8基因全长的c DNA,与p MD19-T载体连接后进行测序鉴定;将p LVX-IRES-puro目的载体与测序正确的S100A8片段进行连接,筛选阳性克隆后进行菌落PCR、双酶切及测序鉴定。结果:p LVXS100A8重组质粒双酶切及菌落PCR产物与目的基因相关片段S100A8 c DNA大小一致,成功克隆S100A8基因,S100A8基因成功插入到p LVX-IRES-puro。结论:成功构建了人S100A8基因高表达的重组慢病毒表达载体。 展开更多

关键词 基因 克隆细胞 高表达 慢病毒载体 构建

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野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1真核表达载体的构建及其在小鼠足细胞中的表达

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作者 王春花 李林 +5 位作者 傅鹏 李金花 原爱红 孙向华 蒋晓峰 余晨 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期780-784,共5页

目的构建野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)真核表达载体,并观察其在小鼠足细胞中表达。方法以总RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增得到小鼠dynactin-1的全长cDNA,将该片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)-FLAG和pEG... 目的构建野生型和突变型小鼠动力蛋白激活蛋白1(dynactin-1)真核表达载体,并观察其在小鼠足细胞中表达。方法以总RNA反转录合成的cDNA为模板,通过PCR扩增得到小鼠dynactin-1的全长cDNA,将该片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)-FLAG和pEGFP-N1;利用部位特异性突变插入方法构建突变型表达载体,经酶切和测序鉴定;各载体转染小鼠足细胞MPC5后,用蛋白质印迹分析法和免疫荧光显微镜法检测dynactin-1蛋白表达。结果 PCR扩增得到大小为3.8kb的小鼠dynactin-1片段,连接到载体后,酶切鉴定电泳结果分别显示pcDNA3.1(+)-FLAG(5.4kb)、pEGFP-N1(4.7kb)以及小鼠dynactin-1(3.8kb)片段,测序分析结果显示克隆的野生型和突变型小鼠dynactin-1序列与数据库序列相同;蛋白质印迹分析法检测到重组dynactin-1的蛋白条带;免疫荧光显微镜观察到dynactin-1主要表达在小鼠足细胞的细胞质。结论成功构建了野生型和突变型小鼠dynactin-1真核表达载体,并在足细胞中表达,为进一步开展细胞生物学研究奠定了实验基础。 展开更多

关键词 动力蛋白激活蛋白1 真核表达载体 足细胞

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RACK1及其缺失突变体与CLIC1的共定位研究

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作者 王蓓华 朱亮亮 +1 位作者 刘晓颖 范礼斌 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2015年第11期1543-1547,共5页

目的运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶C受体1(RACK1)突变体的真核表达质粒,进行RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)蛋白的共定位研究,为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长c DNA序列为模板,构建真核... 目的运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶C受体1(RACK1)突变体的真核表达质粒,进行RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)蛋白的共定位研究,为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长c DNA序列为模板,构建真核表达质粒pc DNA3.1-RACK1-N(1-138)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1-C(130-317)-FLAG;Western blot法检测突变体在哺乳动物细胞中的表达;用免疫荧光技术了解突变体蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果成功构建了RACK1突变体的真核表达质粒;Western blot法检测到蛋白主要在胞质中表达,核内有部分表达;免疫荧光实验表明,RACK1及突变体蛋白主要定位在胞质与核膜,细胞核中也有少量表达,与CLIC1蛋白存在共定位。结论成功构建了RACK1缺失突变体,并在真核细胞中成功表达;RACK1及突变体与CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中均存在不同程度的共定位,蛋白之间可能存在相互作用,为RACK1蛋白的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 RACK1 质粒构建 转染 免疫荧光 Western BLOT

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