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Survivin基因RNAi真核表达载体对HL-60细胞增殖及凋亡的影响 被引量：3
1
作者 王琰 孙玲 +1 位作者 赵国强 王业生 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期454-457,共4页
目的构建Survivin的shRNA表达质粒并将其导入白血病细胞株HL-60细胞以探讨RNA干扰对HL-60细胞增殖及凋亡的影响。方法设计、合成两对针对survivin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pSINsi-Hu6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shR... 目的构建Survivin的shRNA表达质粒并将其导入白血病细胞株HL-60细胞以探讨RNA干扰对HL-60细胞增殖及凋亡的影响。方法设计、合成两对针对survivin的shRNA序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pSINsi-Hu6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2。pSIN/shRNA1转染HL60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果酶切分析和测序证实pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2构建成功。MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shRNA1入HL-60细胞48、72和96h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组组比较,差异有显著性(P<0.05)。流式细胞仪分析pSIN/shRNA1组胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%。结论成功地构建了survivin基因RNAi真核表达载体,且pSIN/shRNA1可序列特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡,为白血病的基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 SURVIVIN基因 RNA干扰 短发夹状RNA 白血病 HL60细胞
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白芨ISSR-PCR反应体系的建立及优化 被引量：5
2
作者 刘亭 金露 +3 位作者 兰波 何彬 李靖 王永林 《贵阳医学院学报》 CAS 2014年第4期455-458,462,共5页
目的:建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础。方法:应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2+、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应... 目的:建立并优化白芨ISSR-PCR反应体系,为白芨种质资源分子评价奠定技术基础。方法:应用单因素和正交试验研究ISSR-PCR反应体系中模板DNA、Mg2+、引物、dNTP、BSA及Taq DNA聚合酶等6个主要成分对扩增结果的影响,优化出ISSR-PCR最佳反应体系。结果:优化后25μL反应体系中含100 ng DNA模板、2.0 mmol/L Mg2+、2.5μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP浓度、3.75 g/L BSA及1.25 U Taq DNA聚合酶。结论:建立了适用于白芨的ISSR-PCR最佳反应体系。 展开更多
关键词 白芨 简单序列重复区间扩增多态性技术 聚合酶链反应 体系优化 单因素试验 正交试验
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实时荧光定量PCR法检测糖尿病肾病大鼠肾脏中BMP-2与MGP 被引量：2
3
作者 赵安菊 黄颂敏 +2 位作者 欧三桃 王里 陈超 《贵阳医学院学报》 CAS 2011年第5期460-464,共5页
目的:检测糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏中骨形成蛋白2(BMP-2)和基质Gla蛋白(MGP)的基因表达量的变化规律,探讨其对糖尿病肾病的影响。方法:设对照组(N组)及糖尿病肾病组(DN组,STZ诱导的DN大鼠模型);采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)方法检... 目的:检测糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏中骨形成蛋白2(BMP-2)和基质Gla蛋白(MGP)的基因表达量的变化规律,探讨其对糖尿病肾病的影响。方法:设对照组(N组)及糖尿病肾病组(DN组,STZ诱导的DN大鼠模型);采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)方法检测4、12、24周DN大鼠及正常大鼠肾脏中BMP-2及MGP的基因定量,茜素红染色观察肾实质内小动脉周围钙盐沉积。结果:(1)DN组各时间点血糖及24 h尿蛋白量均较N组显著增高(P<0.05),自第12周开始,DN组血肌酐、血磷较N组明显增高(P<0.05);(2)DN组4周时BMP-2 mRNA已有表达,随时间延长表达逐渐升高,24周最高(P<0.05);DN组MGP表达量4周最高,随时间延长逐渐降低,24周最低(P<0.05),而N组BMP-2和MGP mRNA各时间点表达量差异均无统计学意义;(3)茜素红染色DN组第4～12周时偶见肾内小动脉少许点状红色钙盐沉积,第24周时可见肾实质内小动脉及周围组织有较多红色点片状沉积,N组茜素红染色为阴性;(4)DN组BMP-2和MGP呈显著负相关(r=-0.494,P<0.01),BMP-2表达与尿蛋白、血肌酐、血磷(r=0.422,P<0.01;r=0.743,P<0.01 r=0.671,P<0.01)呈显著正相关,MGP表达与尿蛋白、血肌酐、血磷(r=-0.511,P<0.01;r=-0.490,P<0.01;r=-0.420,P<0.05)呈显著负相关。结论:DN大鼠肾内小动脉钙化前已有血管钙化标志物BMP-2和MGP的表达,随时间延长BMP-2基因表达量逐渐增多,MGP基因表达量逐渐减少,提示DN大鼠肾脏内BMP-2及MGP基因表达量的变化可能参与DN进展。 展开更多
关键词 糖尿病肾病 骨形态发生蛋白质类 基质GLA蛋白 聚合酶链反应 大鼠 SPRAGUE-DAWLEY
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人端粒相关蛋白T-STAR的克隆及其与端粒酶催化亚单位hTERT的相互作用研究 被引量：1
4
作者 周平 房殿春 +4 位作者 毛高平 张启杰 曹传平 步晓华 刘为纹 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期546-548,共3页
目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与... 目的克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用。方法构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与报告质粒共转染入胃腺癌细胞株SGC-7901,以pM-53＋pVP16-T、pM3-VP16为阳性对照,以pM53＋pVP16-CP为阴性对照;以pM-hTERT＋pVP16、pM＋pVP16-T-STAR、pM＋pVP16为交叉阴性对照。ELISA法检测报告基因CAT的表达。结果成功构建真核表达载体pGBKT7-hTERT,将获得的阳性克隆测序,并进行同源性比较证实为是已收录的人cDNA序列T-STAR。pGBKT7-hTERT和pVP16-T-STAR共转染之后,报告基因CAT的表达（A值为0.258）显著高于阴性对照（A值为0.002~0.015）。结论T-STAR与hTERT在胃癌细胞内发生了相互作用,T-STAR可能是人端粒相关蛋白新成员,通过hTER参与端粒酶活性的调控。 展开更多
关键词 端粒 末端转移酶 端粒结合蛋白质类 双杂交系统技术
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miRNA-196a与宫颈癌的关系研究 被引量：2
5
作者 高冬梅 朱明玥 +2 位作者 唐努尔.阿不力孜 张媛媛 王新玲 《贵阳医学院学报》 CAS 2014年第4期522-525,共4页
目的:探讨miRNA-196a与宫颈癌的相关性。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测35例宫颈癌组织、35例宫颈上皮内瘤样病变组织(CIN)和40例非癌疾病切除的正常宫颈组织中miRNA-196a的表达,分析miRNA-196a与宫颈癌的发生发展的... 目的:探讨miRNA-196a与宫颈癌的相关性。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测35例宫颈癌组织、35例宫颈上皮内瘤样病变组织(CIN)和40例非癌疾病切除的正常宫颈组织中miRNA-196a的表达,分析miRNA-196a与宫颈癌的发生发展的相关性;并通过转染的方法将miRNA-196a转入宫颈癌细胞株Siha中,观察其对Siha细胞迁移和侵袭的影响。结果:相对于CIN组织和非癌疾病切除的正常宫颈组织,宫颈癌组织中miRNA-196a的表达水平明显上调,差异有统计学意义(P<0.01);miRNA-196a的表达水平与患者有无淋巴结转移、临床病理分级、临床分期和间质浸润深度密切相关(P<0.01),但与患者年龄、肿瘤直径大小和绝经与否均无明显关系(P>0.05);转染miRNA-196a可促进Siha细胞的迁移和侵袭。结论:miRNA-196a与宫颈癌的发生发展、迁移、侵袭密切相关。 展开更多
关键词 miRNA-196a 宫颈肿瘤 宫颈上皮内瘤样病变 迁移 侵袭
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HLA-DR1二聚体的构建及其在昆虫细胞中的表达和纯化
6
作者 宋银宏 刘燕 +4 位作者 牛力 翁秀芳 孙伟 于倩 吴雄文 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期305-310,共6页
目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为D... 目的构建HLA-DR1(由DRA和DRB1*01基因编码)杆状病毒表达载体,并使其在昆虫细胞内得到表达。方法采用RT-PCR方法从721.221细胞中扩增DRα和DRβ的信号肽及胞外序列,运用重叠PCR将DRα和DRβ片段分别与Fos和Jun的亮氨酸拉链序列相连,成为DRα-Fos和DRβ-Jun,DRα和DRβ可凭借Fos和Jun的亮氨酸拉链结合形成DR1分子,再通过EcoRⅠ酶切位点将DRα-Fos和人IgG1的Fc段相连,形成DRα-Fos-Fc重组序列,2个同源的DR1分子可通过IgG1的Fc段的二硫键结合形成二聚体。分别将DRα-Fos-Fc及DRβ-Jun插入杆状病毒表达载体pFastBacTMDual的2个多克隆位点处,构建出重组载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc]。对构建的载体进行PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序。采用脂质体转染方法将表达载体转入昆虫细胞系Sf9中,通过双抗夹心ELISA及Westernblot检测HLA-DR1的表达。结果 PCR及酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且序列与GenBank一致。ELISA和Westernblot检测表明DR1杆状病毒感染的Sf9细胞培养上清HLA-DR1表达呈阳性,且表达的HLA-DR1分子具有正确的构象。结论成功构建出杆状病毒表达载体pFastBacTMDual+[DR1/Fc],并在Sf9细胞中得到表达,为研究HLA-DR1限制性的T细胞应答奠定了基础。 展开更多
关键词 HLA-DR1 二聚体 杆状病毒载体 昆虫细胞 基因表达
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Rel-A siRNA对大鼠树突状细胞的影响
7
作者 汪泳 宇汝胜 +2 位作者 周晓俊 秦磊 钱海鑫 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期44-48,共5页
目的探讨siRNA沉默Rel-A基因表达对大鼠树突状细胞(DC)生物学效应的影响。方法采用细胞因子诱导培养法体外扩增大鼠骨髓DC,经免疫磁珠纯化获得高纯度DC后,针对Rel-A基因,采用半定量RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测Rel-... 目的探讨siRNA沉默Rel-A基因表达对大鼠树突状细胞(DC)生物学效应的影响。方法采用细胞因子诱导培养法体外扩增大鼠骨髓DC,经免疫磁珠纯化获得高纯度DC后,针对Rel-A基因,采用半定量RT-PCR及Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测Rel-A的表达情况,筛选一对高效RNA干扰(RNAi)行慢病毒载体包装并转染DC(RNA干扰组),以未转染RNAi的DC作为对照组。分别给予1mg/L的脂多糖(LPS)刺激,透射电镜观察RNAi对LPS促DC成熟的影响,并利用流式细胞术(FCM)检测DC表面CD80,CD86及MHCⅡ分子的变化;混合淋巴细胞反应(MLR)法检测T细胞增殖能力;ELISA法检测DC分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)和白介素12(IL-12)的浓度。结果与空白对照组相比,序列2组降低最明显,抑制率达90%,差异有统计学意义;透射电镜下可见RNAi Rel-A DC内多吞噬泡样结构;RNA干扰组CD80,CD86,MHCⅡ分子的表达、T细胞增殖能力及TNF-α,IFN-γ,IL-12的浓度与对照组相比均显著下降。结论RNA干扰技术能显著下调大鼠Rel-A基因的表达,Rel-A基因沉默DC的生物学效应表现为未成熟DC的特点。这种RNAi Rel-A DC可望作为一种新型的致耐受DC,而应用于免疫耐受的诱导研究。 展开更多
关键词 Rel-A RNA干扰 树突状细胞 基因表达
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双荧光mRFP-eGFP-LC3体系在细胞自噬中的作用 被引量：12
8
作者 黄桢钧 刘彬 +1 位作者 刘本荣 刘少军 《贵阳医学院学报》 CAS 2015年第10期1029-1032,共4页
目的:探讨双荧光mRFP-e GFP-LC3(ptf LC3)体系在细胞自噬中的作用。方法:采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293),蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-... 目的:探讨双荧光mRFP-e GFP-LC3(ptf LC3)体系在细胞自噬中的作用。方法:采用不同浓度雷帕霉素(50、100、200、500、1 000 nmol/L)处理人胚肾细胞(HEK293),蛋白印迹法检测不同浓度雷帕霉素组中自噬标记蛋白(LC3蛋白)的表达及LC3-II/LC3-I比值;单荧光GFP-LC3质粒和双荧光mRFP-e GFP-LC3质粒转染HEK293细胞,雷帕霉素(200 nmol/L)处理3 h,采用荧光显微镜统计,并比较两种方法转染后HEK293细胞内LC3亮点的变化。结果:不同浓度雷帕霉素处理HEK293细胞,LC3-II蛋白和LC3-II/LC3-I比值均增加;转染GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色亮点的数量增加;转染mRFP-e GFP-LC3质粒时,雷帕霉素处理HEK293细胞中绿色和红色亮点数量均增加。结论:双荧光mRFP-e GFP-LC3体系优于单荧光GFP-LC3体系,更能全面完整地反映细胞自噬水平,能够反映细胞内自噬流的变化,是自噬定量分析的可靠方法。 展开更多
关键词 雷帕霉素 自噬 人胚肾细胞 LC3 单荧光GFP-LC3质粒 双荧光mRFP-e GFP-LC3
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低表达miR-1301与卵巢癌患者不良预后的相关分析 被引量：3
9
作者 高红叶 李莲 郑红 《天津医药》 CAS 2017年第3期258-262,共5页
目的利用TCGA数据库分析卵巢癌组织中miR-1301的表达及临床意义,并预测与卵巢癌预后相关的miR-1301的靶基因。方法对TCGA数据库中卵巢癌数据集进行整理,按照miR-1301表达的中位数分为低表达组和高表达组。按照年龄分为<60岁和≥60岁... 目的利用TCGA数据库分析卵巢癌组织中miR-1301的表达及临床意义,并预测与卵巢癌预后相关的miR-1301的靶基因。方法对TCGA数据库中卵巢癌数据集进行整理,按照miR-1301表达的中位数分为低表达组和高表达组。按照年龄分为<60岁和≥60岁;肿瘤位置分为单侧和双侧;临床分期分为早期(Ⅰ+Ⅱ期)和晚期(Ⅲ+Ⅳ期);肿瘤最大径分为<2 cm和≥2 cm;肿瘤分级分为G1+G2和G3+G4;有无残余瘤分为无残余和有残余。卡方检验分析不同临床特征卵巢癌患者miR-1301表达差异是否有统计学意义。采用Kaplan-Meier(K-M)分析不同临床特征患者生存率差异,多因素Cox比例风险回归模型分析卵巢癌患者预后影响因素。利用生物信息学方法预测miR-1301的靶基因并应用K-M法进行生存分析,采用Pearson和Spearman分析靶基因表达与miR-1301表达的相关性。结果不同临床特征卵巢癌患者miR-1301表达差异无统计学意义。K-M生存分析和Cox回归分析显示,miR-1301是影响卵巢癌预后的独立危险因素。miR-1301低表达的卵巢癌患者预后不良(P<0.05)。生物信息学分析显示,miR-1301的靶基因PAQR5、ATP2B1、KPNA3、TSC22D3、PTRF、HS6ST3的高表达与卵巢癌患者不良预后相关,其中PTRF、HS6ST3与miR-1301的表达呈负相关(P<0.05),HS6ST3和PTRF高表达者预后差。结论mi R-1301低表达的卵巢癌患者预后不良,miR-1301可能成为预测卵巢癌患者预后的新靶标。HS6ST3和PTRF为与卵巢癌预后相关的miR-1301的靶基因。 展开更多
关键词 微RNAS 卵巢肿瘤 预后 计算生物学 miR-1301 TCGA数据库
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肿瘤抑制基因XAF1启动子序列中活性IRF-1作用元件的鉴定 被引量：1
10
作者 师雷锋 高春芳 +1 位作者 徐迪辉 王继德 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期388-390,共3页
目的在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件。方法通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30^-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1。应用凝胶电泳... 目的在XAF1的转录起始序列中鉴定一具有高度活性的IRF-1作用元件。方法通过生物信息学分析发现XAF1转录起始处(-30^-38nt)有一潜在的干扰素(IFN)调节因子1结合元件(IRF-E),与同义IRF-E序列同源性达76.2%,命名为IRFE-XAF1。应用凝胶电泳迁移实验(EMSA)检测IRFE-XAF1的核蛋白结合活性,并分别定点突变其核心序列内-34nt和序列旁-28nt,检测突变后XAF1启动子活性变化及对IFN-α作用的影响。结果EMSA实验发现32P标记的含IRFE-XAF1的双链寡核苷酸DNA探针可与细胞核蛋白结合,且可被IRF-E同义探针阻断,定点突变后结合活性丧失,证实该IRFE-XAF1位点具有与转录因子结合的活性。含该IRFE-XAF1位点的XAF1启动子序列具有启动子活性且可被IFN-α诱导,IRFE-XAF1序列定点突变后启动子活性明显降低,其中-34nt突变后完全消除了IFN-α上调启动子活性的作用。结论XAF1的转录起始序列具有一高度活性的IRF-E,其序列为-38ntGAAACGAAA-30nt,这一发现提示XAF1是IFN-α诱导肿瘤细胞分化的作用基因。 展开更多
关键词 XAF1 干扰素调节因子-1 点突变
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过表达mi RNA-21对肾小管上皮细胞TGF-β/Smad信号通路Smad 7蛋白的影响 被引量：1
11
作者 史秋香 吴艳峰 谢丽华 《贵州医科大学学报》 CAS 2017年第10期1134-1138,1163,共6页
目的:探究mi RNA-21过表达对TGF-β/Smad信号通路Smad7蛋白的影响。方法:采用mi RNA-21过表达慢病毒载体和慢病毒空载体分别感染高糖和低糖培养的人肾近端小管上皮细胞HK-2细胞,根据培养基类型和是否感染病毒将细胞分组为高糖mi RNA-21... 目的:探究mi RNA-21过表达对TGF-β/Smad信号通路Smad7蛋白的影响。方法:采用mi RNA-21过表达慢病毒载体和慢病毒空载体分别感染高糖和低糖培养的人肾近端小管上皮细胞HK-2细胞,根据培养基类型和是否感染病毒将细胞分组为高糖mi RNA-21过表达慢病毒组、低糖mi RNA-21过表达慢病毒组、高糖空载组、低糖空载组、高糖细胞组和低糖细胞组,用荧光倒置显微镜观察感染后表达绿色荧光蛋白(GFP)细胞数,通过流式细胞术检测转染率;采用实时荧光定量PCR检测感染后细胞mi RNA-21的表达量,采用Western blot检测Smad7蛋白的表达。结果:感染mi RNA-21过表达慢病毒后,荧光显微镜下HK-2细胞有明显绿色荧光(约为60%),感染率结果显示转染率>60%,实时荧光定量PCR结果显示感染mi RNA-21过表达慢病毒后,高糖转染组细胞mi RNA-21表达量高于高糖细胞组和高糖空载组(P<0.05);Weston blot结果显示高糖转染组Smad 7蛋白的表达低于高糖转染空载病毒组、低糖细胞组、高糖细胞组(P<0.05)。结论:mi RNA-21可以通过抑制Smad7蛋白的表达来调控TGF-β/Smad信号通路。 展开更多
关键词 TGF-Β/SMAD信号通路 SMAD7蛋白 MIRNA-21 慢病毒表达载体 HK-2细胞 实时荧光定量PCR
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β-淀粉样肽对大鼠原代海马神经细胞中SIRTs表达的影响 被引量：2
12
作者 董阳婷 谭龙春 官志忠 《贵州医科大学学报》 CAS 2016年第12期1376-1381,共6页
目的:探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)对原代培养海马神经细胞中沉默信息调节因子(SIRTs)表达的影响。方法:分离出生24 h内SD乳鼠大脑海马区域,培养原代神经细胞,CCK-8试验观察0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0μmol/L Aβ寡聚体(AβOs)对细胞... 目的:探讨β-淀粉样蛋白(Aβ)对原代培养海马神经细胞中沉默信息调节因子(SIRTs)表达的影响。方法:分离出生24 h内SD乳鼠大脑海马区域,培养原代神经细胞,CCK-8试验观察0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5及2.0μmol/L Aβ寡聚体(AβOs)对细胞增殖的影响,选取恰当浓度的AβOs进行后续实验;将实验分为对照组(Control)和Aβ组,Aβ组给AβOs处理24 h后,运用Western blotting方法及Realtime PCR方法检测SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5的蛋白及mRNA表达水平。结果:CCK-8结果显示,0.5μmol/L AβOs作用于大鼠原代海马神经细胞24 h时细胞存活率明显低于对照组(P<0.05),且不影响细胞的存活率;0.5μmol/L AβOs处理大鼠原代海马神经细胞24 h后,与Control相比,SIRT1、SIRT3、SIRT4及SIRT5蛋白及mRNA表达水平均不同程度降低(P<0.05或0.01)。结论:AβOs可使海马神经细胞中SIRTs蛋白及mRNA表达水平降低,这可能与AD病人发病后学习记忆能力减退有关。 展开更多
关键词 阿尔茨海默病 β-淀粉样肽1-42 海马神经元 沉默信息调节因子
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His标记小鼠SRG-S基因的克隆和表达纯化
13
作者 郭睿 张悦红 +2 位作者 张建林 张栋 解军 《山西医科大学学报》 CAS 2006年第5期464-467,共4页
目的构建His标记的小鼠精子发生相关基因SRG-S的原核表达载体并实现其表达及纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆入pGEM-T-easy载体,经测序正确后,定向亚克隆入pET-30a(+)表达载体,... 目的构建His标记的小鼠精子发生相关基因SRG-S的原核表达载体并实现其表达及纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆入pGEM-T-easy载体,经测序正确后,定向亚克隆入pET-30a(+)表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,并利用抗His单克隆抗体进行Western blot检测。结果RT-PCR扩增得到大小约591 bp的目的基因片段,DNA序列分析结果与GenBank公布的序列一致,SDS-PAGE电泳显示经IPTG诱导有约32 kD的重组蛋白表达,纯化后的蛋白纯度达90%以上,且Western blot印迹表明该融合蛋白具有特异的抗His抗体特性。结论采用基因克隆技术成功构建了带His标签的小鼠SRG-S原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,有利于后期抗体的制备,为进一步从蛋白质水平研究该基因的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 原核表达 克隆 分子 遗传载体 纯化
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miR-125a-5p对子宫内膜癌RL95-2细胞增殖凋亡的影响 被引量：2
14
作者 毛小梅 马园园 +3 位作者 周宓 郝小华 黄明 陈必良 《贵州医科大学学报》 CAS 2018年第11期1279-1283,共5页
目的:探讨miR-125a-5p对子宫内膜癌RL95-2细胞增殖、凋亡的影响及可能作用机制。方法:取对数生长期RL95-2细胞随机分为未转染组、mimic阴性对照组和mimic转染组,做相应处理后24 h,采用Real-time PCR检测miR-125a-5p表达,MTT检测细胞增殖... 目的:探讨miR-125a-5p对子宫内膜癌RL95-2细胞增殖、凋亡的影响及可能作用机制。方法:取对数生长期RL95-2细胞随机分为未转染组、mimic阴性对照组和mimic转染组,做相应处理后24 h,采用Real-time PCR检测miR-125a-5p表达,MTT检测细胞增殖,流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved caspase3、cytochrome C)和信号通路相关蛋白(p-AKT、AKT、p-mTOR、m TOR)的表达。结果:同mimic阴性对照组比较,mimic转染组中miR-125a-5p表达显著增加,细胞增殖抑制率和细胞凋亡率明显升高,Bax、cleaved caspase3表达水平显著上调,Bcl-2和线粒体cytochrome C、p-AKT、p-mTOR的表达水平明显下降。结论:miR-125a-5p能够抑制子宫内膜癌RL95-2细胞增殖,机制可能与其改变PI3K/AKT/m TOR通路活性及调节凋亡相关基因有关。 展开更多
关键词 miR-125a-5p 子宫内膜癌 RL95-2细胞 细胞增殖 细胞凋亡
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UCH-L1和GFAP对硬膜外血肿进展的预测价值 被引量：1
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作者 刘俊汝 张广宇 +2 位作者 邓明铷 聂安格 袁海成 《青岛大学学报（医学版）》 CAS 2024年第4期496-500,共5页
目的探讨泛素C末端水解酶-L1(UCH-L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在预测硬膜外血肿(EDH)进展中的价值。方法将雄性新西兰白兔随机分为假手术组(SH组)和EDH0.1、0.2、0.3mL组,每组各24只。于术后1、3、6、24h采血,采用酶联免疫吸附试验法... 目的探讨泛素C末端水解酶-L1(UCH-L1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在预测硬膜外血肿(EDH)进展中的价值。方法将雄性新西兰白兔随机分为假手术组(SH组)和EDH0.1、0.2、0.3mL组,每组各24只。于术后1、3、6、24h采血,采用酶联免疫吸附试验法测定血浆中UCH-L1、GFAP的水平。术后24h进行神经行为学评分、脑含水量检测,采用免疫组织化学法检测大脑皮质中UCH-L1及GFAP的表达。结果与SH组相比,EDH各组的神经行为学评分降低(F=290.10,P<0.001)、脑含水量增加(F=33.64,P<0.001)。4组兔大脑皮质中UCH-L1和GFAP的差异有统计学意义(F=45.90、118.03,P<0.001)。EDH各组血浆UCH-L1水平在术后1、3、6h高于SH组(F=3.15~47.93,P<0.001),血浆GFAP水平在术后各个时间点均高于SH组(F=29.17~332.00,P<0.001)。结论EDH体积增大可以促进损伤侧大脑皮质中UCH-L1和GFAP的表达,上调血浆中二者的水平。大脑皮质和血浆中的UCH-L1和GFAP可作为预测EDH进展的有效生物标志物。 展开更多
关键词 血肿 硬膜外 颅内 生物标记 泛素C末端水解酶-L1 神经胶质原纤维酸性蛋白质
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上皮源性卵巢癌中4种miRNAs的表达及其临床意义 被引量：13
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作者 刘佳宇 赵妍蕊 +2 位作者 张丽娜 闫晔 郑红 《天津医药》 CAS 2015年第9期996-1000,共5页
目的 分析上皮源性卵巢癌（EOC）组织中mi R-200a、mi R-141、mi R-205和mi R-34a的表达及其临床意义。方法 44例EOC患者按FIGO分期分为FIGOⅠ~Ⅱ（FIGO早期组）组15例和FIGOⅢ~Ⅳ（FIGO晚期组）组29例,用实时荧光定量PCR定量比较2组4种... 目的 分析上皮源性卵巢癌（EOC）组织中mi R-200a、mi R-141、mi R-205和mi R-34a的表达及其临床意义。方法 44例EOC患者按FIGO分期分为FIGOⅠ~Ⅱ（FIGO早期组）组15例和FIGOⅢ~Ⅳ（FIGO晚期组）组29例,用实时荧光定量PCR定量比较2组4种mi RNAs的表达差异并考察4种mi RNAs表达间的关联。以各组mi RNAs表达的中位数将EOC患者分为mi RNA高表达组和低表达组,比较2组患者间的生存差异。按年龄、FIGO分期、术后是否有残余瘤及术后化疗情况分组,进行Kaplan-Meier生存分析和Cox多因素分析。结果 FIGO晚期组mi R-141的表达高于早期组（P=0.036）。mi R-141的表达与mi R-200a、mi R-205呈正相关,与mi R-34a呈负相关（均P〈0.05）;mi R-200a与mi R-205的表达呈正相关（P〈0.05）。生存分析显示,mi R-200a的表达低,卵巢癌患者无进展生存期短（P=0.035）,FIGO早期组生存率高于FIGO晚期组（P〈0.05）。mi R-200a的表达水平、FIGO分期以及年龄与卵巢癌患者总生存期和无进展生存期有关,mi R-141、mi R-205和mi R-34a的表达水平、术后残余瘤以及化疗与患者生存无关。结论 mi R-200a的表达与卵巢癌患者预后有关,可能是卵巢癌患者预后预测的独立影响指标。 展开更多
关键词 微RNAS 卵巢肿瘤 上皮-间质转化 上皮源性 MI R-200a MI R-141 MI R-205 MI R-34a
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磁性小干扰RNA纳米微粒的制备及其转染人膀胱癌细胞对沉默survivin基因表达影响的研究(英文) 被引量：5
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作者 曹正国 孙友文 +4 位作者 诸禹平 苏红 吴斌 刘继红 周四维 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期385-390,共6页
目的研究磁性小干扰RNA(siRNA)重组质粒纳米微粒的制备及其在外磁场协同作用下转染人膀胱癌细胞对膀胱癌细胞凋亡和沉默survivin基因表达的影响。方法利用化学共沉淀法制备葡聚糖磁性纳米微粒(DMN)并作为基因载体,通过多聚赖氨酸静电吸... 目的研究磁性小干扰RNA(siRNA)重组质粒纳米微粒的制备及其在外磁场协同作用下转染人膀胱癌细胞对膀胱癌细胞凋亡和沉默survivin基因表达的影响。方法利用化学共沉淀法制备葡聚糖磁性纳米微粒(DMN)并作为基因载体,通过多聚赖氨酸静电吸附作用制备磁性siRNA-survivin-DMN重组质粒纳米微粒,并在外磁场的协同作用下体外转染人膀胱癌BIU-87细胞,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术法、半定量逆转录聚合酶链反应和Western Blotting检测BI-U-87细胞的生长抑制率(IR)、凋亡指数(AI)、survivin mRNA及其蛋白的相对表达水平。结果构建成功的siRNA-DMN直径、有效粒径、比饱和磁化强度分别为10～12nm、94.8nm、0.19emu/g。DMN在外磁场的协同作用下转染siRNA重组质粒入BIU-87细胞后的IR(39.60%)、AI(28.72%)均分别显著高于对照组和无磁场协同作用的siRNA-DMN组(1.99%、3.75%和20.96%、16.71%)(均P<0.05),survivin mRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于后2组。结论磁性siRNA-DMN纳米微粒在外磁场的协同作用下转染BIU-87细胞后可有效抑制survivin基因表达并诱导细胞凋亡,为膀胱肿瘤的磁靶向基因治疗提供实验依据。 展开更多
关键词 小干扰RNA 膀胱肿瘤 SURVIVIN 纳米微粒
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HT29细胞黏着斑激酶表达与其对5-氟尿嘧啶敏感性的关系研究 被引量：5
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作者 陈玉英 杨黎 +1 位作者 潘凤 梁后杰 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期421-424,共4页
目的构建人结肠癌细胞株HT29的RNA干扰(RNAi)表达载体以抑制黏着斑激酶(FAK),检测FAK沉默后细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的变化。方法利用针对FAK基因的特异性寡核苷酸序列及对照序列构建重组体,酶切并测序鉴定,用脂质体2000转染细胞,G... 目的构建人结肠癌细胞株HT29的RNA干扰(RNAi)表达载体以抑制黏着斑激酶(FAK),检测FAK沉默后细胞对5-氟尿嘧啶(5-FU)敏感性的变化。方法利用针对FAK基因的特异性寡核苷酸序列及对照序列构建重组体,酶切并测序鉴定,用脂质体2000转染细胞,G418筛选。采用RT-PCR和免疫组化检测干扰前后细胞内FAK的表达变化,MTT法检测细胞对5-FU敏感性的变化。结果酶切鉴定和测序证实插入序列完全正确。靶向FAK干扰后,免疫组化显示FAK蛋白表达显著降低,RT-PCR显示FAKmRNA的表达下调了76.94%,MTT显示HT29细胞对5-FU敏感性较其他组显著提高,IC50值明显下降(P<0.05)。结论成功构建靶向FAK的RNAi载体并有效抑制了FAK的表达,后者显著提高了HT29细胞对5-FU的敏感性,为寻求新的基因治疗方法提供了可能。 展开更多
关键词 黏着斑激酶 RNA干扰 结肠肿瘤 基因表达
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乙肝病毒X蛋白激活NF-κB信号通路对AFP表达的影响 被引量：5
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作者 任利 陈孝平 +3 位作者 张万广 刘利平 杨盛力 梁慧芳 《中国普通外科杂志》 CAS CSCD 2008年第8期768-772,共5页
目的研究乙肝病毒X蛋白(HBx)通过核因子-κB(NF-κB)信号通路对甲胎蛋白(AFP)的调节作用。方法建立稳定转染HBx基因的L02细胞系(L02-HBx),用特异性的NF-κB信号通路阻断剂PDTC阻断该信号通路,荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后... 目的研究乙肝病毒X蛋白(HBx)通过核因子-κB(NF-κB)信号通路对甲胎蛋白(AFP)的调节作用。方法建立稳定转染HBx基因的L02细胞系(L02-HBx),用特异性的NF-κB信号通路阻断剂PDTC阻断该信号通路,荧光双标激光扫描共聚焦显微镜观察转染前后及加入PDTC前后NF-κB信号通路的激活、失活情况,同时用实时定量PCR和WesternBlot技术检测转染前后及加入PDTC前后AFP在mRNA及蛋白水平上的表达变化。结果以L02细胞为参照,转染HBx基因后的L02-HBx细胞NF-κB信号通路被激活,AFPmRNA和蛋白水平较转染前分别增加(2.78±0.43)倍和(4.72±0.53)倍,差异有统计学意义(P<0.05);PDTC作用24h后L02/HBx细胞NF-κB信号通路阻断,AFPmRNA和蛋白表达分别为(1.40±0.16)倍和(3.12±0.44)倍,与未加入PDTC作用的L02-HBx细胞相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NF-κB信号通路是HBx上调AFP表达的途径之一。 展开更多
关键词 乙型肝炎病毒X蛋白 甲胎蛋白 核因子-ΚB 信号通路 癌 肝细胞
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原发性肝细胞癌与癌旁组织中TRPC6表达的研究 被引量：4
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作者 孙宏伟 沈锋 +4 位作者 王以政 赵义军 张诗琳 李成林 崔彦 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期115-115,共1页
关键词 钙通道 肝肿瘤 基因表达
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