[目的]探究miR-325-3p靶向PRDX4对肾细胞癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。[方法]设肾细胞癌细胞Caki-1组、miR-NC组、miR-325-3p-mimics组(过表达)、miR-325-3p-inhibitor组(低表达),测定各组细胞增殖、单克隆形成数目、凋亡率、侵袭水...[目的]探究miR-325-3p靶向PRDX4对肾细胞癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。[方法]设肾细胞癌细胞Caki-1组、miR-NC组、miR-325-3p-mimics组(过表达)、miR-325-3p-inhibitor组(低表达),测定各组细胞增殖、单克隆形成数目、凋亡率、侵袭水平以及miR-325-3p、PRDX4水平。[结果]miR-325-3p-inhibitor组OD值(0.93±0.03)、存活率(86.58±6.36)%、单克隆形成数目(1062.29±102.78)、穿膜数(1917.34±425.35)、PRDX4 mRNA和蛋白表达水平(4.63±0.28、1.82±0.18)高于miR-325-3p-mimics组[(0.42±0.02)、(42.25±7.20)%、(239.89±35.27)个、(293.85±95.28)个、(2.04±0.24)、(0.38±0.07)](P<0.05),细胞凋亡率(1.12±0.29)%、miR-325-3p表达水平(1.42±0.38)低于miR-325-3p-mimics组(7.14±1.11)%、(5.68±0.37)(P<0.05)。[结论]miR-325-3p上调可以抑制肾细胞癌细胞的增殖(76.59%±7.30%vs 42.25%±7.20%)、迁移侵袭(702.28±111.52 vs 293.85±95.28),同时诱导细胞凋亡(3.46±1.04 vs 7.14±1.11),而这些过程主要是通过miR-325-3p与PRDX4的相互作用实现的。展开更多
[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞...[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞后用梯度稀释法得到阳性单克隆细胞;采用Western blotting和qRT-PCR检测CTNNB1及其下游基因的mRNA和蛋白质表达水平;采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。[结果]成功构建稳定敲低CTNNB1的A549细胞系,与A549-shNC相比,A549-shCTNNB1细胞中CTNNB1的mRNA表达降低(1.01±0.05 vs 0.40±0.004,P<0.0001),β-catenin的蛋白表达降低(0.95±0.10 vs 0.47±0.16,P<0.05);细胞增殖有减缓的趋势,增殖相关基因COX2、CCND1、c-MYC的mRNA表达降低(0.978±0.02 vs 0.66±0.09,P<0.01);MMP2/9的mRNA表达降低(0.98±0.001 vs 0.20±0.08,P<0.0001),MMP2/9蛋白表达降低(0.96±0.05 vs 0.70±0.05,P<0.05),细胞迁移能力减弱(0.91±0.02 vs 0.69±0.05,P<0.01);CCL4的mRNA表达上调(1.87±0.39 vs 6.27±0.60,P<0.001)。[结论]敲低CTNNB1的A549细胞增殖速度减缓,迁移能力减弱,且趋化因子CCL4的mRNA表达上调。展开更多
CRISPR-Cas technology has revolutionized our ability to understand and engineer organisms,evolving from a singular Cas9 model to a diverse CRISPR toolbox.A critical bottleneck in developing new Cas proteins is identif...CRISPR-Cas technology has revolutionized our ability to understand and engineer organisms,evolving from a singular Cas9 model to a diverse CRISPR toolbox.A critical bottleneck in developing new Cas proteins is identifying protospacer adjacent motif(PAM)sequences.Due to the limitations of experimental methods,bioinformatics approaches have become essential.However,existing PAM prediction programs are limited by the small number of spacers in CRISPR-Cas systems,resulting in low accuracy.To address this,we develop PAMPHLET,a pipeline that uses homology searches to identify additional spacers,significantly increasing the number of spacers up to 18-fold.PAMPHLET is validated on 20 CRISPR-Cas systems and successfully predicts PAM sequences for 18 protospacers.These predictions are further validated using the DocMF platform,which characterizes protein-DNA recognition patterns via next-generation sequencing.The high consistency between PAMPHLET predictions and DocMF results for Cas proteins demonstrates the potential of PAMPHLET to enhance PAM sequence prediction accuracy,expedite the discovery process,and accelerate the development of CRISPR tools.展开更多
[目的]探讨SRSF2/tGLI1轴调控Her2阳性乳腺癌侵袭的潜在机制。[方法]在TCGA和GEO数据集(GSE12276、GSE2034、GSE2603、GSE5327、GSE14020)中,分析SRSF2在正常组织和HER2阳性乳腺癌组织中的表达水平以及对无远处转移生存的影响。过表达...[目的]探讨SRSF2/tGLI1轴调控Her2阳性乳腺癌侵袭的潜在机制。[方法]在TCGA和GEO数据集(GSE12276、GSE2034、GSE2603、GSE5327、GSE14020)中,分析SRSF2在正常组织和HER2阳性乳腺癌组织中的表达水平以及对无远处转移生存的影响。过表达或敲低SRSF2或GLI1后,检测HER2阳性乳腺癌细胞SKBR-3、HCC1419、AU-565的侵袭细胞数。敲低SRSF2后分析GLI1的剪接形式,并且过表达GLI1不同剪接形式(fGLI1和tGLI1)后检测HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭细胞数。[结果]在TCGA和GEO数据集中,与正常组织相比,HER2阳性乳腺癌组织中SRSF2的mRNA表达上升5倍(1.00±0.05 vs 5.74±0.37,P<0.05)。同时,SRSF2高表达的HER2阳性乳腺癌患者具有更短的无远处转移生存(P<0.05)。过表达SRSF2后,HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭细胞数上升2倍(152.88±25.15个vs 376.47±32.31个,P<0.05)。敲低SRSF2后,HER2阳性乳腺癌细胞中fGLI1的mRNA表达上升,tGLI1的mRNA表达下降。过表达tGLI1后,HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭细胞数上升3倍(147.43±21.99个vs 397.42±34.03个,P<0.05)。[结论]SRSF2通过选择性剪接将GLI1剪接成tGLI1的形式后,可促进HER2阳性乳腺癌的侵袭能力(152.88±25.15 vs 376.47±32.31,P<0.05)。展开更多
[目的]探讨乳腺癌细胞分泌琥珀酸盐促进巨噬细胞极化的潜在机制。[方法]不同乳腺癌细胞系或正常乳腺上皮细胞的培养上清培养人巨噬细胞后,分析TAM标志物Arg1、Fizz1、Mgl1的表达以及巨噬细胞极化为TAM水平。检测乳腺癌细胞和正常乳腺上...[目的]探讨乳腺癌细胞分泌琥珀酸盐促进巨噬细胞极化的潜在机制。[方法]不同乳腺癌细胞系或正常乳腺上皮细胞的培养上清培养人巨噬细胞后,分析TAM标志物Arg1、Fizz1、Mgl1的表达以及巨噬细胞极化为TAM水平。检测乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中琥珀酸盐的水平并评估其对巨噬细胞极化为TAM的影响。分子对接和表面等离子共振分析琥珀酸与琥珀酸受体(SUCNR1)的结合位点。[结果]乳腺癌细胞上清培养的巨噬细胞中TAM标志物的表达水平上升(1.00±0.08 vs 19.71±1.80,P<0.05),并且巨噬细胞极化为TAM的水平上升(1.00±0.10 vs 4.89±0.44,P<0.05)。乳腺癌细胞上清中琥珀酸的水平显著上升[(0.09±0.01 vs 0.63±0.04)mmol/L,P<0.05]。不同浓度琥珀酸处理后,巨噬细胞中TAM标志物的表达水平呈浓度依赖性上升(1.00±0.01 vs 26.14±0.21,P<0.05),并且巨噬细胞极化为TAM的水平上升(1.00±0.04 vs 4.10±0.23,P<0.05)分子对接和表面等离子共振显示琥珀酸盐与SUCNR1结合于R81、N173和S178位点。[结论]乳腺癌细胞分泌的琥珀酸盐与巨噬细胞SUCNR1的R81、N173和S178结合后促进了巨噬细胞发生M2极化为TAM(1.00±0.10 vs 4.89±0.44)。展开更多
文摘[目的]探究miR-325-3p靶向PRDX4对肾细胞癌细胞增殖、侵袭及凋亡的影响。[方法]设肾细胞癌细胞Caki-1组、miR-NC组、miR-325-3p-mimics组(过表达)、miR-325-3p-inhibitor组(低表达),测定各组细胞增殖、单克隆形成数目、凋亡率、侵袭水平以及miR-325-3p、PRDX4水平。[结果]miR-325-3p-inhibitor组OD值(0.93±0.03)、存活率(86.58±6.36)%、单克隆形成数目(1062.29±102.78)、穿膜数(1917.34±425.35)、PRDX4 mRNA和蛋白表达水平(4.63±0.28、1.82±0.18)高于miR-325-3p-mimics组[(0.42±0.02)、(42.25±7.20)%、(239.89±35.27)个、(293.85±95.28)个、(2.04±0.24)、(0.38±0.07)](P<0.05),细胞凋亡率(1.12±0.29)%、miR-325-3p表达水平(1.42±0.38)低于miR-325-3p-mimics组(7.14±1.11)%、(5.68±0.37)(P<0.05)。[结论]miR-325-3p上调可以抑制肾细胞癌细胞的增殖(76.59%±7.30%vs 42.25%±7.20%)、迁移侵袭(702.28±111.52 vs 293.85±95.28),同时诱导细胞凋亡(3.46±1.04 vs 7.14±1.11),而这些过程主要是通过miR-325-3p与PRDX4的相互作用实现的。
文摘[目的]利用shRNA慢病毒载体构建敲低CTNNB1的A549细胞系,检测其对细胞增殖迁移及对趋化因子CCL4表达的影响。[方法]设计靶向CTNNB1基因的shRNA序列,克隆至pLKO.1慢病毒载体中得到重组干扰质粒。运用三质粒系统包装慢病毒;转导A549细胞后用梯度稀释法得到阳性单克隆细胞;采用Western blotting和qRT-PCR检测CTNNB1及其下游基因的mRNA和蛋白质表达水平;采用实时无标记细胞分析实验检测细胞增殖能力,通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。[结果]成功构建稳定敲低CTNNB1的A549细胞系,与A549-shNC相比,A549-shCTNNB1细胞中CTNNB1的mRNA表达降低(1.01±0.05 vs 0.40±0.004,P<0.0001),β-catenin的蛋白表达降低(0.95±0.10 vs 0.47±0.16,P<0.05);细胞增殖有减缓的趋势,增殖相关基因COX2、CCND1、c-MYC的mRNA表达降低(0.978±0.02 vs 0.66±0.09,P<0.01);MMP2/9的mRNA表达降低(0.98±0.001 vs 0.20±0.08,P<0.0001),MMP2/9蛋白表达降低(0.96±0.05 vs 0.70±0.05,P<0.05),细胞迁移能力减弱(0.91±0.02 vs 0.69±0.05,P<0.01);CCL4的mRNA表达上调(1.87±0.39 vs 6.27±0.60,P<0.001)。[结论]敲低CTNNB1的A549细胞增殖速度减缓,迁移能力减弱,且趋化因子CCL4的mRNA表达上调。
基金supported by grants from the Foundation for Distinguished Young Talents in Higher Education of Guangdong,China(2024KQNCX157)Our work was also supported in part by the Guangdong Provincial Key Laboratory of Interdisciplinary Research and Application for Data Science,BNU-HKBU United International College(2022B1212010006)+1 种基金in part by the Guangdong Higher Education Upgrading Plan(2021-2025)of“Rushing to the Top,Making Up Shortcomings and Strengthening Special Features”(R0400001-22)Additionally,we acknowledge support from the Zhuhai Basic and Applied Basic ResearchFoundation(2220004002717).
文摘CRISPR-Cas technology has revolutionized our ability to understand and engineer organisms,evolving from a singular Cas9 model to a diverse CRISPR toolbox.A critical bottleneck in developing new Cas proteins is identifying protospacer adjacent motif(PAM)sequences.Due to the limitations of experimental methods,bioinformatics approaches have become essential.However,existing PAM prediction programs are limited by the small number of spacers in CRISPR-Cas systems,resulting in low accuracy.To address this,we develop PAMPHLET,a pipeline that uses homology searches to identify additional spacers,significantly increasing the number of spacers up to 18-fold.PAMPHLET is validated on 20 CRISPR-Cas systems and successfully predicts PAM sequences for 18 protospacers.These predictions are further validated using the DocMF platform,which characterizes protein-DNA recognition patterns via next-generation sequencing.The high consistency between PAMPHLET predictions and DocMF results for Cas proteins demonstrates the potential of PAMPHLET to enhance PAM sequence prediction accuracy,expedite the discovery process,and accelerate the development of CRISPR tools.
文摘[目的]探讨SRSF2/tGLI1轴调控Her2阳性乳腺癌侵袭的潜在机制。[方法]在TCGA和GEO数据集(GSE12276、GSE2034、GSE2603、GSE5327、GSE14020)中,分析SRSF2在正常组织和HER2阳性乳腺癌组织中的表达水平以及对无远处转移生存的影响。过表达或敲低SRSF2或GLI1后,检测HER2阳性乳腺癌细胞SKBR-3、HCC1419、AU-565的侵袭细胞数。敲低SRSF2后分析GLI1的剪接形式,并且过表达GLI1不同剪接形式(fGLI1和tGLI1)后检测HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭细胞数。[结果]在TCGA和GEO数据集中,与正常组织相比,HER2阳性乳腺癌组织中SRSF2的mRNA表达上升5倍(1.00±0.05 vs 5.74±0.37,P<0.05)。同时,SRSF2高表达的HER2阳性乳腺癌患者具有更短的无远处转移生存(P<0.05)。过表达SRSF2后,HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭细胞数上升2倍(152.88±25.15个vs 376.47±32.31个,P<0.05)。敲低SRSF2后,HER2阳性乳腺癌细胞中fGLI1的mRNA表达上升,tGLI1的mRNA表达下降。过表达tGLI1后,HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭细胞数上升3倍(147.43±21.99个vs 397.42±34.03个,P<0.05)。[结论]SRSF2通过选择性剪接将GLI1剪接成tGLI1的形式后,可促进HER2阳性乳腺癌的侵袭能力(152.88±25.15 vs 376.47±32.31,P<0.05)。
文摘[目的]探讨乳腺癌细胞分泌琥珀酸盐促进巨噬细胞极化的潜在机制。[方法]不同乳腺癌细胞系或正常乳腺上皮细胞的培养上清培养人巨噬细胞后,分析TAM标志物Arg1、Fizz1、Mgl1的表达以及巨噬细胞极化为TAM水平。检测乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中琥珀酸盐的水平并评估其对巨噬细胞极化为TAM的影响。分子对接和表面等离子共振分析琥珀酸与琥珀酸受体(SUCNR1)的结合位点。[结果]乳腺癌细胞上清培养的巨噬细胞中TAM标志物的表达水平上升(1.00±0.08 vs 19.71±1.80,P<0.05),并且巨噬细胞极化为TAM的水平上升(1.00±0.10 vs 4.89±0.44,P<0.05)。乳腺癌细胞上清中琥珀酸的水平显著上升[(0.09±0.01 vs 0.63±0.04)mmol/L,P<0.05]。不同浓度琥珀酸处理后,巨噬细胞中TAM标志物的表达水平呈浓度依赖性上升(1.00±0.01 vs 26.14±0.21,P<0.05),并且巨噬细胞极化为TAM的水平上升(1.00±0.04 vs 4.10±0.23,P<0.05)分子对接和表面等离子共振显示琥珀酸盐与SUCNR1结合于R81、N173和S178位点。[结论]乳腺癌细胞分泌的琥珀酸盐与巨噬细胞SUCNR1的R81、N173和S178结合后促进了巨噬细胞发生M2极化为TAM(1.00±0.10 vs 4.89±0.44)。
