胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)是由肠道菌群中部分微生物产生并且广泛分布于动物胃肠道中的一种胞内酶,具有优良的胆酸盐水解活性。该研究旨在克隆并原核表达植物乳植杆菌胆盐水解酶(Lactobacillus plantarumbile bile salt hydr...胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)是由肠道菌群中部分微生物产生并且广泛分布于动物胃肠道中的一种胞内酶,具有优良的胆酸盐水解活性。该研究旨在克隆并原核表达植物乳植杆菌胆盐水解酶(Lactobacillus plantarumbile bile salt hydrolase,LpBSH),系统研究其酶学特性和结构特征,为开发新型降脂酶制剂提供理论基础。通过基因工程技术构建重组LpBSH表达系统,测定其酶学性质并进行动力学分析。结合生物信息学方法,对LpBSH的三维结构、活性位点及底物结合口袋进行预测和分析。结果表明,原核表达的LpBSH在最适条件下活性为88.7 U/mL,显著高于野生型。重组LpBSH在pH为6.5时活性最高,并在pH_(4).5~6.5范围内保持较高活性;K+对LpBSH水解活性有轻微促进作用,而重金属离子普遍抑制活性;动力学分析显示,LpBSH催化反应符合Hill方程,表现出底物正协同效应;通过生物信息学分析LpBSH的氨基酸序列并预测其三维结构特征,研究了关于其氨基酸序列、活性位点、底物结合口袋及底物偏好性的关系。该研究为深入理解LpBSH的结构与功能关系及其在动物胆固醇代谢中的作用奠定了基础,并为LpBSH酶制剂的开发提供了科学依据。展开更多
DNA shuffling是蛋白质定向进化的一种常用策略,其优点是可以快速积累多突变效果,但同时由于突变数较多,其中真正发挥作用的突变及其结构基础往往不清楚。β-葡萄糖苷酶是纤维素高效降解的限速酶,良好的热稳定性是影响其实际催化效率的...DNA shuffling是蛋白质定向进化的一种常用策略,其优点是可以快速积累多突变效果,但同时由于突变数较多,其中真正发挥作用的突变及其结构基础往往不清楚。β-葡萄糖苷酶是纤维素高效降解的限速酶,良好的热稳定性是影响其实际催化效率的关键因素。该研究以DNA shuffling策略产生的热稳定性β-葡萄糖苷酶突变体Bgl3-6511(含60个突变,T_(50)值比野生型提高4.6℃)为研究对象,通过序列比对、定点突变和热稳定性测定,对其中的有益突变进行鉴定。结果显示,6个单点突变Y50F、R52H、R56K、V65I、T67A和P143A分别将该酶的T_(50)值提高2.9、4.2、1.5、2.8、3.2、1.2℃。同时,鉴定到5个有害突变将该酶的T_(50)值降低1.0~3.4℃。将获得单点有益突变进行组合,获得T_(50)值提高13.4℃的M6(Y50F/R52H/R56K/V65I/T67A/P143A),说明DNA shuffling策略积累的有害突变确实损害了性能优化。结构分析和分子动力学模拟显示,有益突变主要是通过增强分子内氢键、π-π键和稳定二级结构发挥作用。该研究对Bgl3-6511中的单点有益突变进行鉴定,对其结构基础进行了分析,并获得了热稳定性更加优良的突变酶,相关信息可为其他酶的分子改造提供有益借鉴。展开更多
文摘胆盐水解酶(bile salt hydrolase,BSH)是由肠道菌群中部分微生物产生并且广泛分布于动物胃肠道中的一种胞内酶,具有优良的胆酸盐水解活性。该研究旨在克隆并原核表达植物乳植杆菌胆盐水解酶(Lactobacillus plantarumbile bile salt hydrolase,LpBSH),系统研究其酶学特性和结构特征,为开发新型降脂酶制剂提供理论基础。通过基因工程技术构建重组LpBSH表达系统,测定其酶学性质并进行动力学分析。结合生物信息学方法,对LpBSH的三维结构、活性位点及底物结合口袋进行预测和分析。结果表明,原核表达的LpBSH在最适条件下活性为88.7 U/mL,显著高于野生型。重组LpBSH在pH为6.5时活性最高,并在pH_(4).5~6.5范围内保持较高活性;K+对LpBSH水解活性有轻微促进作用,而重金属离子普遍抑制活性;动力学分析显示,LpBSH催化反应符合Hill方程,表现出底物正协同效应;通过生物信息学分析LpBSH的氨基酸序列并预测其三维结构特征,研究了关于其氨基酸序列、活性位点、底物结合口袋及底物偏好性的关系。该研究为深入理解LpBSH的结构与功能关系及其在动物胆固醇代谢中的作用奠定了基础,并为LpBSH酶制剂的开发提供了科学依据。
