目的:探讨敲除溶酶体跨膜蛋白175(transmembrane protein 175,TMEM175)对HeLa细胞线粒体功能的影响。方法:传代培养HeLa细胞系,分为野生型(wild-type,WT)组和TMEM175敲除(knockout,KO)组。采用Western blot技术检测TMEM175、溶酶体关联...目的:探讨敲除溶酶体跨膜蛋白175(transmembrane protein 175,TMEM175)对HeLa细胞线粒体功能的影响。方法:传代培养HeLa细胞系,分为野生型(wild-type,WT)组和TMEM175敲除(knockout,KO)组。采用Western blot技术检测TMEM175、溶酶体关联膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1,LAMP1)、LAMP2和转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)等蛋白表达;LysoSensor染色测定溶酶体酸度变化;分别采用JC-1和Mito-SOX探针测定线粒体膜电位及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;应用O2K高分辨率线粒体呼吸测定系统和ATP试剂盒测定线粒体耗氧率和ATP含量;采用Western blot技术测定线粒体动力学及能量代谢关键分子包括线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)、发动蛋白相关蛋白1(dynaminrelated protein 1,Drp1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及电子呼吸链复合体等的蛋白表达。结果:与WT组相比,KO组细胞中TMEM175蛋白表达水平显著降低(P<0.01),溶酶体酸度增加(P<0.05),LAMP1表达水平降低(P<0.05),LAMP2和磷酸化TFEB蛋白水平升高(P<0.05)。缺失TMEM175后细胞线粒体膜电位降低(P<0.01),线粒体ROS水平升高(P<0.01),线粒体基础呼吸和漏呼吸能力减弱(P<0.01),ATP生成相关呼吸及ATP含量增加(P<0.05或P<0.01)。WT组和KO组细胞中Mfn2和OPA1蛋白表达无显著差异(P>0.05),KO组细胞磷酸化Drp1增加(P<0.05),AMPK蛋白表达及活性均显著增加(P<0.05),线粒体复合体I、IV蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:敲除HeLa细胞TMEM175引起溶酶体酸化,溶酶体相关蛋白表达改变,并抑制线粒体功能,激活Drp1和AMPK信号。展开更多
文摘目的:探讨敲除溶酶体跨膜蛋白175(transmembrane protein 175,TMEM175)对HeLa细胞线粒体功能的影响。方法:传代培养HeLa细胞系,分为野生型(wild-type,WT)组和TMEM175敲除(knockout,KO)组。采用Western blot技术检测TMEM175、溶酶体关联膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1,LAMP1)、LAMP2和转录因子EB(transcription factor EB,TFEB)等蛋白表达;LysoSensor染色测定溶酶体酸度变化;分别采用JC-1和Mito-SOX探针测定线粒体膜电位及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;应用O2K高分辨率线粒体呼吸测定系统和ATP试剂盒测定线粒体耗氧率和ATP含量;采用Western blot技术测定线粒体动力学及能量代谢关键分子包括线粒体融合蛋白2(mitofusin 2,Mfn2)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)、发动蛋白相关蛋白1(dynaminrelated protein 1,Drp1)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)及电子呼吸链复合体等的蛋白表达。结果:与WT组相比,KO组细胞中TMEM175蛋白表达水平显著降低(P<0.01),溶酶体酸度增加(P<0.05),LAMP1表达水平降低(P<0.05),LAMP2和磷酸化TFEB蛋白水平升高(P<0.05)。缺失TMEM175后细胞线粒体膜电位降低(P<0.01),线粒体ROS水平升高(P<0.01),线粒体基础呼吸和漏呼吸能力减弱(P<0.01),ATP生成相关呼吸及ATP含量增加(P<0.05或P<0.01)。WT组和KO组细胞中Mfn2和OPA1蛋白表达无显著差异(P>0.05),KO组细胞磷酸化Drp1增加(P<0.05),AMPK蛋白表达及活性均显著增加(P<0.05),线粒体复合体I、IV蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。结论:敲除HeLa细胞TMEM175引起溶酶体酸化,溶酶体相关蛋白表达改变,并抑制线粒体功能,激活Drp1和AMPK信号。
