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基因脱毒百日咳疫苗菌株目的基因拷贝数双重TaqMan探针qPCR检测方法的建立及验证
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作者 卜祥利 孙也婷 +4 位作者 张立志 赵冉 林纪胜 李晶 王淼 《中国生物制品学杂志》 2025年第5期595-604,共10页
目的建立基因脱毒百日咳疫苗菌株改造基因百日咳毒素(pertussis toxin,PT)的拷贝数双重TaqMan探针qPCR检测方法,筛选最佳内参基因,以评估改造菌株的传代稳定性。方法设计改造基因PT和多个管家基因的特异性引物及探针,基于双重TaqMan探针... 目的建立基因脱毒百日咳疫苗菌株改造基因百日咳毒素(pertussis toxin,PT)的拷贝数双重TaqMan探针qPCR检测方法,筛选最佳内参基因,以评估改造菌株的传代稳定性。方法设计改造基因PT和多个管家基因的特异性引物及探针,基于双重TaqMan探针qPCR法,使用GeNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT软件筛选最佳内参基因,通过相对定量法计算基因脱毒百日咳疫苗菌株PT目的基因拷贝数;对建立的方法进行特异性、线性、重复性验证。以基因脱毒百日咳疫苗生产用P1、P3、P5、P10、P15代菌株基因组DNA为模板,用建立的双重TaqMan探针qPCR法评估菌株传代稳定性。结果通过GeNorm、NormFinder、Bestkeeper、Delta CT软件分析内参基因稳定系数得出Rpob为最适内参基因。标准菌株58003既能扩增出PT目的基因,又能扩增出Rpob内参基因;样品浓度在0.001~10 ng/μL范围内,Ct值与样本量呈良好的线性关系,R2≥0.990;P1代菌株6次检测2-△△Ct值均在0.87~1.25之间,RSD小于20%。各代次菌株PT目的基因均为单拷贝,传代稳定性良好。结论建立的双重TaqMan探针qPCR法引物特异性、重复性好,可用于基因脱毒百日咳疫苗生产用菌株的传代稳定性评估,进而评价菌株质量。 展开更多
关键词 基因脱毒 百日咳疫苗 目的基因拷贝数 双重TaqMan探针qPCR 传代稳定性
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