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泛素蛋白融合系统高效表达幽门螺杆菌可溶性铁蛋白及多抗制备
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作者 朱艳平 何勇 +5 位作者 张心杰 姚倩文 代佳怡 岳锋 吴玉苹 王选年 《新乡学院学报》 2024年第12期24-31,共8页
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)铁蛋白是储存铁和维持细胞铁平衡的一种蛋白质,在不同生物中均有发现,但铁蛋白氨基酸序列同源性低,这为利用铁蛋白建立Hp分子生物学和免疫学检测方法提供了理论依据。为获得泛素蛋白(small ubiquitin... 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)铁蛋白是储存铁和维持细胞铁平衡的一种蛋白质,在不同生物中均有发现,但铁蛋白氨基酸序列同源性低,这为利用铁蛋白建立Hp分子生物学和免疫学检测方法提供了理论依据。为获得泛素蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)融合系统高效表达的可溶性Hp铁蛋白,根据GenBank中Hp铁蛋白基因序列,设计合成引物,PCR扩增Hp铁蛋白基因片段,构建重组克隆菌株,菌液PCR、双酶切和序列测定筛选阳性克隆。双酶切后回收目的基因,构建pET-28a-SUMO-Ferritin重组表达质粒,转化至DH5α。通过菌液PCR、双酶切和序列测定,获得阳性重组表达菌株pET-28a-SUMO-Ferritin/BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白。然后,利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得高纯度目的蛋白。最后,利用获得的高纯度重组蛋白免疫小鼠制备多抗。结果显示实验扩增出了501 bp的Hp铁蛋白基因。IPTG诱导重组原核表达菌株,SDS-PAGE检测显示在34 kDa处有一条与理论值相符的条带;Western blotting鉴定SUMO融合重组蛋白,结果显示它能与His抗体特异性结合。37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导过夜,SUMO融合重组蛋白呈可溶性表达。将去除SUMO标签后的重组蛋白纯化,透析,获得高纯度重组蛋白,免疫小鼠后抗体水平为1∶25600。研究结果表明,利用SUMO融合系统可高效表达可溶性Hp铁蛋白,免疫小鼠制备多抗,为进一步获得Hp铁蛋白的单抗,建立Hp免疫学检测方法奠定基础。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 铁蛋白 泛素蛋白 SUMO蛋白酶I 多抗 抗体效价
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