目的探讨WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolinhomologous protein 1,WAVE1)调控脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞线粒体代谢异常和炎症反应的机制。方法构建过表达WAVE1的巨...目的探讨WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolinhomologous protein 1,WAVE1)调控脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞线粒体代谢异常和炎症反应的机制。方法构建过表达WAVE1的巨噬细胞系(小鼠BMDM和人THP-1细胞),LPS(500 ng/mL)处理巨噬细胞模拟脓毒症炎症反应,实验分为两部分。第一部分设立对照组、LPS组、空载质粒(LPS+oe-NC)组、WAVE1过表达(LPS+oe-WAVE1)组;第二部分设立LPS组、LPS+oe-NC组、LPS+oe-WAVE1组、外源性高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)干预(LPS+oe-WAVE1+HMGB1)组。采用RT-PCR法测定线粒体DNA含量,RT-qPCR法检测WAVE1、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6 mRNA表达,免疫印迹法检测WAVE1、己糖激酶2、丙酮酸激酶M2蛋白表达,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1含量,JC-1染色法检测线粒体膜电位,Seahorse XP96法检测耗氧率和细胞外酸化率,MitoSOX探针检测线粒体活性氧水平,2-NBDG法检测葡萄糖摄取水平,试剂盒检测丙酮酸激酶活性、乳酸、三磷酸腺苷、HMGB1水平。结果与对照组相比,LPS组WAVE1蛋白和mRNA表达、线粒体膜电位、耗氧率、线粒体DNA含量降低(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6含量和mRNA表达、线粒体活性氧、葡萄糖摄取、乳酸、三磷酸腺苷、己糖激酶2和丙酮酸激酶M2蛋白表达水平以及细胞外酸化率、丙酮酸激酶活性、HMGB1释放量升高(P<0.05);与LPS+oe-NC组相比,LPS+oe-WAVE1组WAVE1蛋白和mRNA表达、线粒体膜电位、耗氧率、线粒体DNA含量升高(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6含量和mRNA表达、线粒体活性氧、葡萄糖摄取、乳酸、三磷酸腺苷、己糖激酶2和丙酮酸激酶M2蛋白表达水平以及细胞外酸化率、丙酮酸激酶活性、HMGB1释放量降低(P<0.05)。与LPS+oe-WAVE1组比较,LPS+oe-WAVE1+HMGB1组葡萄糖摄取、乳酸、三磷酸腺苷水平及细胞外酸化率升高(P<0.05)。结论WAVE1通过调控炎症因子释放、线粒体代谢及HMGB1释放参与调控LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。展开更多
文摘目的探讨WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(Wiskott-Aldrich syndrome protein family verprolinhomologous protein 1,WAVE1)调控脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞线粒体代谢异常和炎症反应的机制。方法构建过表达WAVE1的巨噬细胞系(小鼠BMDM和人THP-1细胞),LPS(500 ng/mL)处理巨噬细胞模拟脓毒症炎症反应,实验分为两部分。第一部分设立对照组、LPS组、空载质粒(LPS+oe-NC)组、WAVE1过表达(LPS+oe-WAVE1)组;第二部分设立LPS组、LPS+oe-NC组、LPS+oe-WAVE1组、外源性高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1,HMGB1)干预(LPS+oe-WAVE1+HMGB1)组。采用RT-PCR法测定线粒体DNA含量,RT-qPCR法检测WAVE1、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6 mRNA表达,免疫印迹法检测WAVE1、己糖激酶2、丙酮酸激酶M2蛋白表达,ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1含量,JC-1染色法检测线粒体膜电位,Seahorse XP96法检测耗氧率和细胞外酸化率,MitoSOX探针检测线粒体活性氧水平,2-NBDG法检测葡萄糖摄取水平,试剂盒检测丙酮酸激酶活性、乳酸、三磷酸腺苷、HMGB1水平。结果与对照组相比,LPS组WAVE1蛋白和mRNA表达、线粒体膜电位、耗氧率、线粒体DNA含量降低(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6含量和mRNA表达、线粒体活性氧、葡萄糖摄取、乳酸、三磷酸腺苷、己糖激酶2和丙酮酸激酶M2蛋白表达水平以及细胞外酸化率、丙酮酸激酶活性、HMGB1释放量升高(P<0.05);与LPS+oe-NC组相比,LPS+oe-WAVE1组WAVE1蛋白和mRNA表达、线粒体膜电位、耗氧率、线粒体DNA含量升高(P<0.05),TNF-α、IL-1β、IL-6含量和mRNA表达、线粒体活性氧、葡萄糖摄取、乳酸、三磷酸腺苷、己糖激酶2和丙酮酸激酶M2蛋白表达水平以及细胞外酸化率、丙酮酸激酶活性、HMGB1释放量降低(P<0.05)。与LPS+oe-WAVE1组比较,LPS+oe-WAVE1+HMGB1组葡萄糖摄取、乳酸、三磷酸腺苷水平及细胞外酸化率升高(P<0.05)。结论WAVE1通过调控炎症因子释放、线粒体代谢及HMGB1释放参与调控LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。
