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人胚胎干细胞培养及其cDNA文库的构建 被引量：5
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作者 周素芳 Angela M Eastham peter l stern 《中国现代医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第17期2049-2053,共5页
目的构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础。方法培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切... 目的构建人胚胎干细胞cDNA文库,为筛查疾病抗原基因奠定基础。方法培养和收集人胚胎干细胞克隆,提取胚胎干细胞总RNA,分离纯化mRNA,利用mRNA作模板反转录合成双链cDNA,双链DNA经pfu-DNA聚合酶将链末端补平,与EcoRⅠ接头连接,XhoⅠ酶切消化产生粘端。用Sepharose CL2B柱分离纯化及除去小分子cDNA片段,与Uni-ZAP XR噬菌体连接,体外转化XL1-blue MRF'菌,建成cDNA文库并计算重组效率。对cDNA文库进行扩增,测定扩增文库的滴度。阳性重组子用EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定插入片段的大小。结果构建成含1.2×106重组子的人胚胎干细胞cDNA文库,重组子插入外源DNA片段长度不小于1000kb。结论已成功构建人胚胎干细胞cDNA文库,适合用于筛选目的基因克隆。 展开更多
关键词 人胚胎干细胞 CDNA文库 分子克隆
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