文摘目的 基于ICH Q2(R2)和Q14,建立冻干甲型肝炎减毒活疫苗(简称冻甲疫苗)感染性滴度细胞培养-RT-qPCR快速检测方法,并对方法进行优化及验证。方法 采用分析质量源于设计(Analytical Quality by Design,AQbD)理念,通过分析目标概况(Acceptance Test Procedure,ATP)设定、风险识别与实验设计(Design of Experiment,DoE),建立细胞培养-RT-qPCR联合检测平台。以病毒核酸扩增循环阈值(cycle threshold,Ct)为响应指标,优化细胞密度、病毒培养温度和时间等关键参数。验证方法的专属性、线性、中间精密度,确定定量范围,Bland-Altman分析与传统滴度检测方法的一致性。结果 共识别13个主要风险因素,确定方法的最适反应条件为:细胞密度(1~2)×10^(5)个/mL;病毒稀释梯度间距4倍;96孔细胞培养板有边缘效应;病毒吸附温度和时间为37℃吸附60 min,病毒培养温度和时间为35℃培养72 h;PCR无位置效应;变性温度和时间为90℃变性63 s;逆转录温度和时间为60℃逆转录15 min;计算模型为双对数线性模型。该方法具有良好的专属性(灭活病毒对照Ct值> 28)、线性(R2=0.966)及中间精密度[几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)≤9.28%],定量范围覆盖5.0~8.0 lgCCID50/mL。该方法与传统方法检测结果差值的95%一致性界限(95%limits of agree-ment,95%LoA)为-0.06~0.41 lgCCID50/mL。结论 建立的细胞培养-RT-qPCR检测方法将检测周期由传统方法的21~28 d缩短至3 d,且具有定量准确、通量高等优势,为冻甲疫苗工艺过程中及成品甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)滴度检测和批签发效率提升提供了关键技术支持。
