目的分析三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞敲低YTHDF3(YT521-B homology domain family 3)前后的蛋白质表达差异,探究YTHDF3调控TNBC细胞蛋白质功能的可能机制。方法利用分子克隆、靶点设计和病毒载体包装技术构建...目的分析三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞敲低YTHDF3(YT521-B homology domain family 3)前后的蛋白质表达差异,探究YTHDF3调控TNBC细胞蛋白质功能的可能机制。方法利用分子克隆、靶点设计和病毒载体包装技术构建YTHDF3稳定敲低的MDA-MB-231细胞系并采用Western blot法进一步验证。裂解细胞蛋白,采用超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)和液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法获取因敲低YTHDF3而出现的差异表达蛋白。使用String数据库及Cytoscape 3.10.1软件,绘制并分析蛋白质互作网络(protein-protein interaction,PPI)并筛选核心靶点。通过David数据库对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路和基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析。采用RNA干扰技术分别敲低MDA-MB-231和HS-578T细胞中的YTHDF3或UUbiquitin(BBB)基因,Western blot法验证YTHDF3敲低的两种TNBC细胞中核心靶蛋白的表达,并采用Transwell法检测UBB敲低对TNBC细胞侵袭和迁移的影响。结果成功构建了YTHDF3稳定敲低的TNBC细胞模型,并在该细胞中定量到2295个蛋白,筛选出261个差异表达蛋白(126种下调和135种上调)。GO分析结果显示,差异下调蛋白主要涉及翻译和蛋白质稳定性,而对细胞群体增殖的负调控蛋白则是上调表达。KEGG结果表明,差异下调蛋白主要富集于剪接体相关信号通路,而差异上调蛋白主要与凋亡通路相关。PPI分析表明有6个核心靶点(RPS27A、UBA52、UBC、UBB、RPL4和RPS2)下调。Western blot分析揭示YTHDF3敲低的MDA-MB-231和HS-578T细胞中YTHDF3和UBB蛋白表达均降低。Transwell结果指出UBB缺失抑制TNBC细胞侵袭和迁移水平。结论本文以全新视角的研究,揭示了YTHDF3通过调控下游核心靶点UBB在TNBC细胞侵袭转移中发挥着重要作用。展开更多
文摘目的分析三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)细胞敲低YTHDF3(YT521-B homology domain family 3)前后的蛋白质表达差异,探究YTHDF3调控TNBC细胞蛋白质功能的可能机制。方法利用分子克隆、靶点设计和病毒载体包装技术构建YTHDF3稳定敲低的MDA-MB-231细胞系并采用Western blot法进一步验证。裂解细胞蛋白,采用超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)和液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)方法获取因敲低YTHDF3而出现的差异表达蛋白。使用String数据库及Cytoscape 3.10.1软件,绘制并分析蛋白质互作网络(protein-protein interaction,PPI)并筛选核心靶点。通过David数据库对核心靶点进行京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路和基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析。采用RNA干扰技术分别敲低MDA-MB-231和HS-578T细胞中的YTHDF3或UUbiquitin(BBB)基因,Western blot法验证YTHDF3敲低的两种TNBC细胞中核心靶蛋白的表达,并采用Transwell法检测UBB敲低对TNBC细胞侵袭和迁移的影响。结果成功构建了YTHDF3稳定敲低的TNBC细胞模型,并在该细胞中定量到2295个蛋白,筛选出261个差异表达蛋白(126种下调和135种上调)。GO分析结果显示,差异下调蛋白主要涉及翻译和蛋白质稳定性,而对细胞群体增殖的负调控蛋白则是上调表达。KEGG结果表明,差异下调蛋白主要富集于剪接体相关信号通路,而差异上调蛋白主要与凋亡通路相关。PPI分析表明有6个核心靶点(RPS27A、UBA52、UBC、UBB、RPL4和RPS2)下调。Western blot分析揭示YTHDF3敲低的MDA-MB-231和HS-578T细胞中YTHDF3和UBB蛋白表达均降低。Transwell结果指出UBB缺失抑制TNBC细胞侵袭和迁移水平。结论本文以全新视角的研究,揭示了YTHDF3通过调控下游核心靶点UBB在TNBC细胞侵袭转移中发挥着重要作用。
